5. 辖曼-华癸根瘤菌选择性培养基筛选
摘要: 经过多样性研究 后， 我 们 采 用 同 样的数据 进 行 了选择性 培
养 基 筛选 试 验.我们确认了许多作者 曾 经 报 道的 结 果 的 可 重
复性,并且认为三苯甲烷染料对辖曼华癸簇 根 瘤 菌有 较 明 显 的 选 择
作 用， 初 步 确 定 了一 系 列快速确认辖曼根瘤菌的 选 择
性培养基.
5.1.1. 筛选对所有的根瘤菌有选择作用的试剂: 用PROG_GC.PRG运算总共选择性利用T-4.1-A的数据(包括土壤对照的数据). 其 中14个不同土壤类型 来 自成都南郊("成都")， 另14 个来自14个不同环境的辖曼土壤(包括河滩,阴坡,阳坡等 一样红原的土壤;"草原").草原土 样使用之前冰冻十个月,成都土是新鲜的. 在 土 样上清液 中 加 入15%的甘油,-20C保存.倒平板时, 采 用 双 阴 性 对 照，成都 及草原土 样 各 一（ 第4。1。4 节）.在T-4.1-A放弃了因亲缘关系太密切代表性太差的(5-20-26-53)小组.以后设RSC(根瘤菌选择性系数)为:
( 平 板根瘤菌菌株数量/所有的根瘤菌菌株的数量
- 0.5*( 平 板 生 长 的对照菌株的数量/所有对照菌株的数量)
- 成都土 样上 生 长 的细菌菌落数/成都土 样上 生 长
的对照平板上的菌落数[为LN/24,最少为-0.25]
- 草原土样上 生 长 的其上细菌菌落数/草原土样上 生 长
的对照平板上的菌落数[为LN/24,最少为-0.25]) *100
RSC 大 于50 表 示对根瘤菌 有选择作用, 而低RSC表示抑止作用.
5.1.2. 对 某族根瘤菌有选择性的试剂筛选: 用这些数据,我们也注意了对单独族的选择作用.
5.1.4. 选择性试剂的组合: 一种稍微带选择性的溶液(MILSEL)设计了(杆菌肽 50,青酶素 3,溴麝香草芬蓝20,柰啶酮酸50,CoCl2 10在YMA).为了草原根瘤菌设计了更加选择性的溶液(SELSOL=1*MILSOL+孔雀绿20+SeO2 300在YMA).其它的符合培养基为Z01(氯霉素10,溴麝香草芬蓝10,CoCl2 10在乳糖上),Z02(氯霉素10,溴麝香草芬蓝10,CoCl2 10在YMA上),Z03(青酶素5,萘啶酮酸50,溴麝香草酚蓝10,杆菌肽50(这次灭菌之后再加进),CoCl2 10在YMA上),ZO4(青酶素3,杆菌肽50(这次灭菌之后再加进)),ZO5(红霉素20,青霉素3,SeO2 50,溴麝香草酚蓝5,孔雀绿20,萘啶酮酸50,CoCl 10在YMA上),Z06(青霉素3,SeO2 50,溴麝香草酚蓝5,孔雀绿20,萘啶酮酸50,CoCl 10在YMA上).方法如第4.1节.
------------------------------------------------------ 表 T-5.2-A: 若干族的有可能有选择作用化学素 ------------------------------------------------------- RSC substance fast-growing rhizobia vs. non-rhizobia -9 T03 growth at 4oC 1/20 10/19 -7 C03-asparagine-DL 5/20 13/19 -6 C01-ascorbic acid 0/20 4/19 -3 M18 VO3NH4 20000/20 4/19 0 R03 NaCl 150006/20 12/19 67 A05 penicillin 518/19 12/18 69 C28-sorbose 18/21 10/19 70 C14-lactate-DL Na 18/21 11/19 71 M03 CoCl2.H2O 1021/21 13/19 75 T02 growth on bromoth b2018/21 11/19 76 R05 bromothymol blue 75016/21 10/19 78 NM2 SELSOL*0.05 + YMA 5/7 1/7 79 C08-erythritol-meso 18/21 10/19 104 R09 malachite green 2016/20 7/19
vetch rhizobia vs. non-rhizobia
68 C18 maltose 6/6 14/19
69 z11 lactate+chlora+bro+Co3/4 6/14
70 C17-malonate Na 6/6 11/19
71 C30-tartrate-L Na 6/6 11/18
71 M03 CoCl2.H2O 106/6 13/19
73 T02 growth on bromoth b205/6 11/19
74 R09 malachite green 203/6 7/19
78 z04 pen+bactitr 3/3 8/13
83 C28-sorbose 6/6 10/19
84 C14-lactate-DL Na 6/6 11/19
93 C08-erythritol-meso 6/6 10/19
99 R05 bromothymol blue 7506/6 10/19
Xiaman rhizobia vs. non-rhizobia
67 M29 TiO2 100007/7 15/19
67 R02 NO3Na 20007/7 15/19
68 R11 nalidixic acid 2006/7 7/19
68 C18 maltose 7/7 14/19
69 M01 AlCl3.6H2O 3006/6 13/19
69 C13-inositol 7/7 13/19
70 C14-lactate-DL Na 6/7 11/19
70 C17-malonate Na 7/7 11/19
71 C30-tartrate-L Na 7/7 11/18
71 z08 lactate (pH=8.5) 2/2 3/6
71 M03 CoCl2.H2O 107/7 13/19
72 z03 pen+nal+bromot+bacitr4/7 2/14
72 A05 penicillin 57/7 12/18
72 C16-malate-DL 7/7 11/17
75 T02 growth on bromoth b206/7 11/19
80 z06 malg+bromot+Se+Co+bac3/7 1/14
80 C02-anthrone 7/7 12/19
83 C28-sorbose 7/7 10/19
91 NM1 MILSOL*0.05 + YMA 2/2 1/7
106 NM2 SELSOL*0.05 + YMA 2/2 1/7
124 R09 malachite green 206/6 7/19
Halophiles/Sinorhizobia vs. non-rhizobia
67 M29 TiO2 100005/5 15/19
67 R02 NO3Na 20004/4 15/19
68 R07 congo red 30005/5 15/18
69 T02 growth on bromoth b204/5 11/19
69 M01 AlCl3.6H2O 3005/5 13/19
71 M03 CoCl2.H2O 105/5 13/19
72 A05 penicillin 54/4 12/18
79 R05 bromothymol blue 7504/5 10/19
82 R11 nalidixic acid 2005/5 7/19
90 M16 SeO2 3005/5 10/19
93 C08-erythritol-meso 5/5 10/19
94 R12 berberine HCl 2753/5 6/19
104 R09 malachite green 204/5 7/19
115 A03 erythromycin 505/5 5/18
Bradyrhizobia vs. non-rhizobia
67 C28-sorbose 5/6 10/19
68 A02 chloramphenicol 205/6 12/19
68 C18 maltose 6/6 14/19
69 M01 AlCl3.6H2O 3006/6 13/19
71 M03 CoCl2.H2O 106/6 13/19
73 T02 growth on bromoth b205/6 11/19
76 C08-erythritol-meso 5/6 10/19
78 z04 pen+bactitr 4/4 8/13
80 z02 chloram+bromotbl+Co 5/5 8/14
84 C14-lactate-DL Na 6/6 11/19
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备注: 详细的数据见T-4.1-A
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5.2.1. 对于所有的根瘤菌具有选择性 的 试剂: 选择性范围比较广泛的试剂是溴麝香草芬蓝,CoCl2,青酶素及赤藓酮糖.孔雀绿对于快生根瘤菌 选 择 性 较 强, 但它对于豌豆及许多种慢生根瘤菌 具 有抑 制 作 用.
5.2.2. 对于单独根瘤菌簇的选择性: 对 于 中 华根瘤菌 而 言,红霉素,SeO2及黄莲素是比较有选择性.对 于黄芪-红豆草的辖曼根瘤菌,可以考虑蒽酮,山梨糖及有机酸的利用.因为孔雀绿对于大部豌豆及所有的慢生根瘤菌抑制性太大,对 于豌豆根瘤菌 具 有 选 择 性 的 是碳源 和抗生素.对于慢生根瘤菌来说情况也较复杂, 有 迹 象 表 明Co2＋,Al3＋及氯霉素具 有 选 择 性.
5.2.3. 培养基C/N 的 影 响: 虽然有些C源RSC 高, 但 普 遍 存 在 根 瘤 菌生长较 慢(比如松三糖,山梨糖,赤藓酮糖).此外,这些培养基重复 较 差:比如 在赤藓酮糖的重复 试 验 中 仅对照菌 生长 较好. 在另外一些培养基 中所点的 细菌当中只有小数(几个零散的小菌落)能够利用某种碳源(比如Z09:松三糖).
5.2.4. 复合培养基的效果: 有的复合培养基 选 择 性太 强(Z05,Z06),有些 选 择性太 弱.只有慢生根瘤菌复合培养基比 任 何单独的试剂好,而 对辖曼根瘤菌NM1和NM2 的 试 验 中 仅反映 出孔雀绿 具 有 明 显 的选择性.
5.3.1. 已 报 道的选择性试剂的 具 有可重复性: 虽然一般认为检验的重复在显性研究当中是一种比较复杂的问题(#ON 1991), 而金 属离子浓度的影响非常依赖于其它蟹合剂或沉淀剂是否同 时 存在(#HUGHES 1991),比如用硫酸盐还是用氯化盐有一定的区别(#BIRO 1995)1.因为YMA可以说是标准培养基(比如有#SADOWSKY 1983,#陈 1987,#张 1991,#孙 1993, #NOVIKOVA1994, #陈 1995等用它), 其 选 择性 具 有 较 好 的 重 复 性:本 文 的 试 验结果重复了 前 人的 有 关 报 道,比如慢生根瘤菌有#GAULT(1993)4推荐氯酶素,#童(1994)9推荐Co2+/Al3+,在中华根瘤菌#KINKLE(1994)推荐硒酸及#陈(1988)9推荐赤霉素,在豌豆根瘤菌#LOUVRIER(1995)低萍銮嗝顾睾透司.#NEW(1971)1 憔萍龀噢好顾匚炕AGROBACTERIUM RADIOBACTER BIOVAR II.然而, 大 部 分作者认为虽然有的碳源具有一定的选择性, 但同时 抑 制 细 菌 的生长速度(#LOUVRIER 1995).
5.3.2. 辖曼-华癸根瘤菌的抗染料性高:我们发现选择作用最有效的是孔雀绿这种三苯甲烷染料与#PATTISON(1974)挂恢:他也认为该染料对广泛的根瘤菌有选择性作用.化学结构相似的结晶紫,是早期根瘤菌工作者(#CHURCHMAN 1912,#ANDERSON 1929;#FRED 1932提出所用的浓度范围为7-200PPM之内.在南京的#曹(1972)2报告菌株的耐性范围10-1000PPM而短时培养在结晶紫的培养基上没影响它研究的三株紫云英根瘤菌的结瘤或者固氮能力.我们 捎玫呐ǘ认陆峋ё弦种谱饔锰,这大概支持#PATTISON(1974)的同样浓度结晶紫比孔雀绿抑制性大的发现.对于抗孔雀绿的非根瘤菌可以试用萘啶酮酸(200PPM;13/14对4/7)及AlCl3.6H2O (300PPM;13/13对4/7).另外我们数据提示溴麝香草酚蓝对于根瘤菌选择作用也比较大.为证实这些发现该采用更大范围的菌株而来自不同生产者的药品. 比如说,拿天津新鲜在1996年产的孔雀绿的话,4PPM的结果比采用20PPM更好.
这些对于根瘤菌具有选择作用染料之一(结晶紫)用于革兰氏染色;革兰氏染料用于分开(为许多特征之一)细胞壁结果不同的细菌.比较经过染料抗逆性而产生与依赖细胞壁成分的两种分类可能是有趣的.
5.3.3. 快速证实辖曼- 华癸根瘤菌: 建议 利用孔雀绿(4PPM)抗逆性(R09,应该生长),一个复合的选择性液体(NM02,应该生长)和4C下的潜伏(不应该生长).为了确认是否中华根瘤菌可以利用柠檬酸或者酒石酸上的生长(T-4.2-C),而辖曼-华癸根瘤菌在LB一律不能生长,中华根瘤菌此有时不同.
以后本人在MARBURG大学再调查更宽范围的根瘤菌对于三甲酚基烷然料的抗耐性.