Xue Hong pouring plates 
显示第一批的细菌（N01是认为选的）。
上面的菌落相当与T-4.2-A前30个菌株 （1-27号）。点菌从左面上头开始；
每行六个菌株；每平板5行。4. 数值分类法鉴定野生根瘤菌
摘要：采用表型特征的数值分类法研究了由根瘤中分离出的细菌的多样性。因为生长活力区别比较大，不得不发展一种新的相似系数。这样产生的分类明显分开了根瘤菌和冰箱污染菌。来自黄龙寺的野生根瘤菌属于豌豆及中华根瘤菌，来自辖曼的根瘤菌接近华癸根瘤菌。
4.1.1.野生菌株的分离及保存：菌株一部分分离自温带若尔盖县辖曼及松潘县黄龙寺，一部分来自亚热带的成都南郊。有关菌株的来源详细的记录见"DATASET.RHI";SUUGLRZ200-250号的宿主植物的标本见四川大学标本室和潭仲明老师的标本。有关SUUGLRZY，SUUGLRZZ？？及SUUGLZU？？的菌株的详细记录请参考DATASET.TRA。1993-94年采母鲇么KCl的试管，1995年的用带液体石蜡的衣披管保存，1996年直接在野外分离。
干燥的根瘤在无菌水中浸泡过夜，经过80%的酒精，0.1%的HgCl2
(或10%的H2O2 )1-3分钟表面灭菌(#JORDAN（1984）。表面灭菌后，将根瘤榨碎的涂布到#VINCENT（1970）YMA培养基（+25PPM刚果红）的平板上。采用画线法分离单菌落，用VINCENT的YMA在冰箱4C保存，每年转种两次。值得一提，结瘤实验（多数作者认为这时鉴定根瘤菌最关键的步骤，#JORDAN
1984）只有两个成功（SUUGLRZ208与苜蓿，SUUGLRZ215与野豌豆，试验设计：斜面如VINCENT
1970），因此本分类比较特色的是不但用于分辨不同的菌株，而还是用于鉴定区分根瘤菌。
4.1.2. 对照菌株的来源：9个模式菌株来自北京中国农大陈文新教授，还有两个菌株来自洪雅县的花生（#张1996）。阴性对照：2种杆菌（杆菌在若尔盖土壤是最优势的，#龙章富1994），硝酸菌（可能带污染，长得很快）和土壤菌(代表ALPHA-变形纲)，假产碱假单胞菌（BETA-变形纲),大肠秆菌和弧菌(GAMMA-变形纲），一些球菌和黄色咸迅司醋源ù蟾鹕苋倮鲜盎饕酱螅
------------------------------------------------------------------ 表 T-4.1-A: 所 分 析 的 菌 株 ------------------------------------------------------------------- 号 菌 株 宿 主 植 物 或 种 类 来 源 ------------------------------------------------------------------- 01 y043 SUUGLRZ221 Medicago lupulina L. Huanglongsi 02 Y057 SUUGLRZ223 Oxytropis kansuensis Bge. Xiaman 03 y071 SUUGLRZO-11 Onobrychis viciaefolius Xiaman** 04 y084 SUUGLRZO-02 Onobrychis viciaefolius Xiaman 05 Y089 SUUGLRZY03-0 O.kansuensis Xiaman 06 Y099 SUUGLRZX6-8 Vicia sativa L. Chengdu<7font>
07 y102 SUUGLRZO-14 Onobrychis viciaefolius Xiaman
08 Y105 N15 JM107 Escherichia coli
09 y113 SUUGLRZO-05 Onobrychis viciaefolius Xiaman
10 Y149 N16 Staphylococcus aureus
11 Y171 SUUGLRZ248 Astragalus mahoschanicus Xiaman
12 Y180 SUUGLRZO-03 Onobrychis viciaefolius Xiaman
13 Y182 SUUGLRZ208 Melilotus suaveolens Ledeb. Huanglongsi
14 P184 SUUGLRZ215 Vicia sativa L. Huanglongsi
15 Y206 SUUGLRZ94361 Trigonella archiducis-nicolai Huanglongsi
16 Y214 SUUGLRZ211 Vicia sativa L. Huanglongsi
* Y230 SUUGLRZ234 Onobrychis viciaefolia Scop. Xiaman
17 Y251 SUUGLRZX1-3 Glycine max Chengdu
18 y252 SUUGLRZY21-7 A.sungpanensis Xiaman
19 y281 SUUGLRZX6-9 Glycine max Chengdu
20 Y301 SUUGLRZ94364 Astragalus mahoschanicus Tangke
21 Y325 HAMBI 540 [=T2] Rhizobium galegae Finland
22 Y335 SUUGLRZX3-1 Glycine max/arrow-leafed cv Chengdu
23 Y338 N22 Nitrobacter sp
24 Y364 N03 Cocci (undetermined)
25 P413 SPR2-9 Arachis hypogaea Hongya
26 Y429 SUUGLRZZ07-5 L.pratensis Xiaman
27 Y450 USDA205 [=T6] Sinorhizobium fredii Central N China
*
*
28 Y459 SUUGLRZ236 Vicia sativa L. Xiaman
29 Y498 NZP2213 [=T9] Rhizobium loti New Zealand
* P518 SUUGLRZO-17 Onobrychis viciaefolius Xiaman
30 y535 SUUGLRZ229 Astragalus prattii Xiaman
31 Y541 CIAT899 [=T4] Rhizobium tropici Mexico
32 Y543 SUUGLRZ200 Trigonella archiducis-nicolai Huanglongsi
33 Y578 N02 B-13 Bacillus thuringiensis
34 P580 SUUGLRZ201 Medicago lupulina L. Huanglongsi
35 Y612 N01 AS 1.398 Bacillus subtilis
36 Y642 SUUGLRZ94380 Hedysarum tanguticum Fedtsch. Heishui
37 y645 SUUGLRZX6-2 Vicia faba Chengdu
38 y680 SUUGLRZ224 Vicia faba L. Xiaman
39 Y691 SUUGLRZX6-5 Trifolium repens Chengdu
40 Y712 USDA2370 [=T3] Rhizobium leguminosarum USA
41 Y731 N19 Vibrio sp
42 Y738 USDA1002 [=T5] Rhizobium meliloti USA
43 Y771 SUUGLRZX6-7B Vicia sativa L. Chengdu
44 Y799 CCBAU2609 [=T7] Rhizobium huakuii Nanjing
45 P816 SUUGLRZZ18-03(25)A.polycladus Xiaman
46 Y850 CCBAU3306 [=T1] Rhizobium tianshanense Xinjiang
47 Y861 N04 Pseudomonas pseudoalcaligenes
48 Y886 SUUGLRZX6-6 Trifolium repens Chengdu
49 Y903 SUUGLRZ94378 Hedysarum tanguticum Fedtsch. Heishui
50 y919 SPR2-8 Arachis hypogaea Hongya
51 Y945 USDA6 [=T8] Bradyrhizobium japonicum USA
52 Y957 SUUGLRZO-18 Onobrychis viciaefolius Xiaman
53 y961 SUUGLRZO-12 Onobrychis viciaefolius Xiaman
54 Y966 SUUGLRZZ14-1 A.polycladus Xiaman
* X6-7A (/Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (WHY)
* 219 (/X6-7A) Vicia sativa Chengdu
----------------------------------------------------------------------
备注: 有*的菌株未满足后面的聚类分析的要求(第4.1.8节),但仍出现于数据表4.2.**本小区曾经接种黄龙寺/辖曼根瘤菌混合肥
----------------------------------------------------------------------
4.1.3. 生物实验的选择：有关根瘤菌分类或者对于根瘤菌有选择性的培养基输入了到数据库(DATASET。SEL，包括有关250个因素的来自二十余篇文章的八百余记录；见盘上的附录），椐此选择了对根瘤菌选择性或"获得信息量大"（比如浓度接近LD50）的检验方法。
4.1.4. C/N利用和耐性检验：检验分成两批：第一批在Medium.PGM培养基中添加2000PPM浓度的各种C/N源；第二批把耐性试剂加到VINCENT的YMA培养基上（在表T-4。2-A上的空号默认为PPM）。然后将培养基（一般放在100ML的三角瓶）在121C下灭菌15分钟。
4.1.5.
其它的生化检测方法（第二批）：
T01: 3-酮苷糖化验(#BERNAERTS
1963):首先把在(乳糖 10000,酵母膏
1000)培养基中培养9天(28℃),然后用Benedict试剂浅层覆盖.
所有的土壤杆菌产生的3-酮苷糖在室温浸泡1小时后,即可形成一个黄色的CuO2环.
Benedict(本尼迪)试剂（配10ML）：Na2CO3 100000,硫酸铜 17300,
柠檬酸钠 173000(#志田1981)
T02:有机酸检验:在附加溴麝香草酚蓝 20(#NORRIS
1965)6的培养基上,培养8天,检查琼脂是否变色(从蓝色到黄色).
T03-06:在不同的温度下观测细菌在YMA和LB的生长状况.
T07:黑色素的产生(#CUBO
1988)5:在附加L-酪氨酸 600及CuSO4 40的TY培养基上（=胰蛋白胨
5000，酵母膏 3000，CaCl2.6H2O 1300,#BERINGER 1974))培养3-4天,
长得好的菌落用0.05ml含10%(w/v)SDS的TBE(pH=8.3)处理.然后室温培养1-24小时,即可发现黑色素的形成.
T08:在缺镁条件下对锰的耐受性:用缺镁的MEDIUM。PGM加上MnSO4 2000
T09:酸性条件下对锰的耐受性:用pH=5.0的YMA加上MnSO4 2000
T10:红豆草的结瘤实验（半封闭系统，摸索若尔盖的气候）
4.1.6.平板接种：倒好的平板倒置培养过夜.用接种环从斜面挑取菌落,每一环菌于2ML无菌水中稀释,然后点平板(使菌落位置固定).
Xue Hong pouring plates 显示第一批的细菌（N01是认为选的）。
上面的菌落相当与T-4.2-A前30个菌株 （1-27号）。点菌从左面上头开始；
每行六个菌株；每平板5行。
4.1.7. 评价菌落生长:在28C下培养平板(除非温度实验以外),观察菌落生长.根据#JORDAN(1984)焐鼍(RHIZOBIUM属)在YMA在2-4天之内形成可见的菌落(直径2-4MM);而慢生根瘤菌在同样条件下在5-7天内才形成直经约1MM的菌落.为了保证检验的可重复性,我们九天以后观察所有的菌株(无论是快生还是曼生的),以后到DATASET.TAX输入"N"(没长),"B"(长得不好,可以看见,但几乎不带色),"Y"(正常,不透明),"S"(拈性,菌落一般4MM以上)和"?"(不清楚,未测).在不同的温度生长实验直接输入第一次看到菌落的天数.
-----------------------------------------------------------------------------------------------
表 T-4.1-B 若干统计两个菌株相似性的方法(摘自PROG_CLU.C)
-------------------------------------------------------------------------------------------------
float GetEuclidDistFromContigencyTable
(float sima,float disb,float disc,float simd,char methchoice)
{
/*sima and simd refer to similarities in a 2*2 contingency table, and correspond exactly to a and d in #Sneath 1973,#Zhong 1990 or the Chi-square test; disb and disc correspond to the dissimilarities b and c; methchoice is the method of calculating an Euclidean distance matrix chosen*/
float tmpsim; /*similarity (of two strains or other things)*/
if (sima+simd+disb+disc==0) return 1; /*no data*/
if (methchoice==1) /*Simple matching coefficient, reviewed by #Sneath 1973*/
tmpsim=((sima+simd)/(sima+simd+disb+disc));
if (methchoice==2) /*Positive matching, #Sneath 1957*/
{if (sima+disb+disc>0) tmpsim=(sima)/(sima+disb+disc);else return 1;}
if (methchoice==3) /*Matching without vigor, #Sneath 1968*/
tmpsim=1-(2*sqrt(disb*disc))/(sima+simd+disb+disc);
if (methchoice==4) /*Matching without vigor, #Sneath 1968,a more general version
for discovering strong NEGATIVE relations (useless in the
in the original bacteriological context, but might prove useful
for non-bacteriological applications)*/
{
if (disb*disc<disb*simd)
{
tmpsim=1-(2*sqrt(disb*disc))/(sima+simd+disb+disc);
rel_modal=0;
}
else
{
tmpsim=1-(2*sqrt(disb*simd))/(sima+simd+disb+disc);
rel_modal=1;
}
}
if ((methchoice==6) || (methchoice==7))
/*premanipulating data for modified Chi-square*/
{
float minsim,mindis; /*minimal values for similarity & dissimilarity
in 2*2 contingency table*/
if (sima<simd) minsim=fabs(sima); else minsim=fabs(simd);
if (disb<disc) mindis=fabs(disb); else mindis=fabs(disc);
if (methchoice==6) /*modified Chisquare*/
{sima=simd=minsim;disb=disc=mindis;}
if (methchoice==7) /*semimodified Chisquare*/
{
sima=minsim/2+sima/2;
simd=minsim/2+simd/2;
disb=mindis/2+disb/2;
disc=mindis/2+disc/2;
}
}
if ((methchoice==5)/*original Chisquare,algorithm following #Wall 1986*/
|| (methchoice==6) /*modified Chisquare*/
|| (methchoice==7) /*semimodified Chisquare*/)
{
tmpsim=sima*simd-disb*disc; /*do a chisquare if possible*/
if (tmpsim<(0.5*(sima+simd+disb+disc)/*Yates correction*/
+0.0001/*safety valve for inaccurate number crunching*/)
|| (!(sima+disb)||!(simd+disb)||!(sima+disc)||!(simd+disc)))
/*data insatisfactory*/
return 1;
else {
tmpsim-=0.5*(sima+disb+disc+simd);
tmpsim*=tmpsim;
tmpsim*=(sima+disb+disc+simd);
tmpsim/=((sima+disb)*(simd+disb)*(sima+disc)*(simd+disc));
tmpsim/=(1+tmpsim);
}
}
if (tmpsim>1) printf("Calculation error of similarity in clusterit.");
return (sqrt(1-tmpsim)); /*Euclidean distance, #Sneath 1973*/
}
--------------------------------------------------------------------------------------------------
Note: This to ensure readability of this ANSI C function for those having a background in other structured programming languages it should be noted that e.g. a*=b means a=a*b, a+=b means a=a+b; || means the logical or; sqrt(x) means square root of x. Of course, the variable type of the input variables (sima,simd,disb,disc) could be replaced by integers, but this would necessitate a lot of type conversions and result in quite unesthetic code.
--------------------------------------------------------------------------------------------------
4.1.8. 菌株的聚类分析:采用UPGMA聚类(#陈1986,#SNEATH 1973)牡ANSI C程序分析,满足总阳性率20-80%,而每批阳性率10-90%的菌珠包括在分析内.采用了不同的方法运算两种菌珠之间的相似性(T-4.1-B及PROG_CLU.C).为了对照,进行WAGNER-FARRIS进化枝分析(#钟1990:173).
4.1.9. 检验的聚类分析:用同样的数据表,我们用同样的方法来分类生物检验.这次阳性检验10-90%包括在分析内.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 表T-4.2-A:生化检验的结果(DATASET.TAX) 60个菌株的生长状况 成 草 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- A01 bacitracin 50杆菌肽 _ysyyys_ynynyy_ynbysb_syyyyy_yyyy??_sy?yyy_yyynyy_ybnyyy_yyyyyy_yyyyyy 131 976 A02 chloramphenicol 20氯霉素 _yyyyny_nnnyyn_ynnysn_bbnnby_ybnn??_yn?yyn_nynyyy_ynnnyn_ynynny_yynynn 64 72 A03 erythromycin 50红霉素 _ynynnn_nnnyyn_y??yyn_bnnnny_nnnb??_nn?nnn_nbnyny_nnnyny_nbnnyb_nsnnnn 15 16 A04 gentamicin 10庆大霉素 _nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnny_nnnn??_nn?nnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn 2 0 A05 penicillin 5青酶素 _ssyyys_ynybyn_yynysn_syyyby_?nyy??_sb?ysn_nybyyy_syny?y_y?ynyy_yyyyyy 177 340 A06 streptomycin 10链霉素 _yssyyy_ynyyyn_yynysn_sbyyyy_byyb??_sb?yyy_yyyyyy_ynnyyy_ybbnyy_byyyyy 352 372 C01-ascorbic acid 抗坏血酸 _nnnYny_nnnnYn_nnnn?n_nnnnny_nnnnnn_nn?nnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnyn_nnnn?? 181024 C02-anthrone 蒽酮 _yyYyyy_YYynYn_nnyn?n_yynyyn_nnnnnn_yynyyn_nynyyy_ynnyxy_ynyyyy_yyyy?? 3 968 C03-asparagine-DL 天门冬氨酸 _yyyyyY_nnnyny_yNyn?n_ynynny_nnyynn_yynnyn_ynnyny_nnnynn_nnynyn_nnyy?? 51 508 C04-benzoate Na 苯甲酸钠 _yynYyY_nnYyyY_Ynnn?n_yyyyny_nyynnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnynyy_nnyy?? 12 832 C05 citrate Na 柠檬酸钠 _nyyyny_nnyyny_nnnn?n_yyyyny_nnynnn_ynnyyn_ynnyny_nnnnny_ynynyy_yyyy?? 481368 C06-cysteine-L 半胱氨酸 _yNNNyy_Ynynyn_ynyn?n_ynnnny_nnnynn_yynyyn_nynyny_ynyynn_nnynyn_nnnn?? 28 800 C07-dulcitol 半乳糖醇 _yyyyyy_ynyNyn_Nyyy?y_ynyyny_nnyynn_yyyyyy_yynyyy_yynyyy_ynyyyy_yyyy?? 69 896 C08-erythritol-meso 赤鲜糖醇 _yNyyny_YYNnyn_yyyy?y_ynnyyy_nynynn_ynnyyy_nynnyy_nynyyn_yyyyyy_ynnn?? 7 69 C09-ethanolamine 乙醇胺 _yyyyyy_ynyNyy_yYyy?y_ynyyyy_?yyynn_yyyyyn_yynyyy_yynyyy_yyyyyy_yyyy?? 62 764 C10-gluconate-D Na 葡萄糖酸钠 _yyyyyy_ynyyy?_Nyyy?n_yyyyyy_nyyynn_ynyyyy_yynyyy_yynyyy_yyyyyy_yyyy?? 78 880 C11-hydroxyquinoline-8 羟基喹啉 _nnnnnn_nnnnnn_nnnn?n_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nn?nnn_nn?nnn_nnnn?? 0 0 C12-hippurate Na 马尿酸钠 _yyyyyy_yNyYyn_yyyy?y_yyyyyy_nyyynn_yyyyyy_yynyyy_yyyyyy_yyyyyy_yyyy?? 441024 C13-inositol 肌醇 _yyyyyy_ynynyY_Nyyy?y_ynyyyy_nnyynn_yyyyyy_yynyyy_ynnyyy_ynyyyy_yyyn?? 26 880 C14-lactate-DL Na 乳酸钠 _yyyyny_yNyyyn_Nyny?y_yynyyy_nyyyyn_yynyyy_nynyyy_yynyyn_ynyyyy_yynn??? 5?420 C15 lactose 乳糖 _yyyyyy_ynyyyy_nyyy?y_yyyyyy_nnyynn_yyyyyy_yyn?yy_yynyyy_yyyyyy_yyyy?? 80 924 C16-malate-DL 平果酸 _yyy???_ynyynn_ynyn?n_ynynny_nnynnn_yynyyy_yynyny_yyyyyy_ynynyn_yyyy?? 41 436 C17-malonate Na 丙二酸钠 _yyyyyy_ynynyn_nyyy?n_yyyyny_nnyynn_ynyyyy_nynnyy_yynyyy_ynyyyy_yyyy?? 75 792 C18 maltose 麦芽糖 _yyyyyy_ynyyny_yyyy?y_yyyyyy_nynynn_yyyyyy_yynyyy_yynyyy_ynyyyy_yyyy?? 121336 C19-mannitol 甘露醇 _Yyyyyy_YnyyyN_yyyy?n_ynyyyy_nnyynn_yyyyyy_yynyyy_yynyyy_ynyyyy_yyyy?? 411456 C20-melezitose-D 松三糖 _Yyyyny_Ynynyn_Nyyn?n_yynyny_yynynn_ynnyyn_nynyy?_yynyyn_yyyyyy_yynn?? 6 548 C21-barbital Na 巴比妥钠 _yyyyyy_ynynyY_Nyyy?y_yyyyny_nnyynn_yyyyyy_yynyyy_yynyyy_ynyyyy_yyyy?? 711336 C22-thymol 麝香草酚 _nnnnnn_nnnnnn_nnnn?n_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnn?? 0 0 C23-propionate 丙酸纳 _NyNyyy_nnYyyn_NYyn?n_ynynny_nnynnn_yynynn_nnnnnn_nnnnyn_nnnyyn_ynyy?? 22 0 C24-propanol-o 丙醇-正 _yyyyYy_yNyyyy_yyyy?n_yyyyny_nyyynn_yynyyy_yynyyy_yynyyy_ynyyyy_yyyy??? 28?776 C25-riboflavin 核黄素 _nnnnnn_nnnnyn_nnnn?n_ynnnny_nnnnnn_ynnnnn_nnnnnn_ynnn??_ynnyyy_yyyy?? ??72b C26-salicin 水杨苷 _yyyyyy_YnYnYY_Yyyy?n_ynyyny_ynyynn_yynyyy_yynyyy_yynyyy_ynyyyy_ynyy?? 471568 C27-sorbitol 山黎醇 _yyyyyy_ynyyyY_yyyy?n_yyyyyy_ynyynn_ynyyyy_yyn?yy_yynyyy_ynyyyy_yyyy?? 261232 C28-sorbose 山黎糖 _yyyNyN_ynyyyn_yyyy?y_?ynyny_nynnnn_yyyyyy_nnnyyy_yynyyy_ynnyyy_yyyy?? 5 952 C29-succinate Na 瑚珀酸纳 _yyNyyy_ynyyyN_yy?y?n_?nyyny_nnyynn_yynyyy_yynyyy_yy?yyy_ynyyyy_yyyy?? 40 728 C30-tartrate-L Na 酒石酸钠 _y?yyyy_ynyyYn_nyyy?y_yyynyy_nnynnn_yynyyy_nnnyyn_yynyyy_ynyyyy_yyyy?? 39 896 M01 AlCl3.6H2O 300 _ynynyy_ynsbsn_yyyyyy_yyyyyy_yyyy??_sb?ysy_yyynyy_snnyyy_ssyyyy_y?yyyy 260 406 M02 BaCl 2000 _yyyyyy_nnyyyn_yynyyn_sbyyby_ybyy??_sy?yyy_yybnyn_ybnyyy_nbbn?y_bsyyyy 3601360 M03 CoCl2.H2O 10 _ysyyyy_ynybyy_yynyyb_syyyyy_nbyynn_sy?yyy_yyynyy_ybnyyy_yybnyy_yyyyyy 130 500 M04 CrK(SO4)2.12H2O 500 _ysbyyy_ynybyy_ynynyn_ynyyny_ynyn??_yb?yyy_yyyyny_nnnbnb_nnynyy_byyyy? 561000 M05 K2Cr2O7 10 _yssyyy_ynyyyy_yyyyyb_yyyyyy_bnyy??_sy?yyy_yyyyyn_snnyyy_?ybnyy_yyyyss 294 860 M06 CuCl2.2H2O 100 _nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnn??_nn?nnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn 1 0 M07 CuCl2.2H2O 20 _nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnn??_nn?nnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn ?0?3? M08 CuSO4.5H2O 20 _nnnnnn_nnnnnn_bnnnnn_bnnnnn_nnnn??_nn?nnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn 114 27 M09 FeC6H5O7:XH2O 300 _ysysys_ynyyyn_ynynyn_snyyny_bnyy??_sy?yyn_yyyyyy_nnnyny_nyynyy_syyyyy 2051656 M10 La(NO)3xH2O 150 _ysyyyy_yynysy_yynyyn_ynyyny_ybyynn_sy?ssy_ysyyyy_yynnsy_ysynyy_yyyyyn 384 812 M11 LiCl.H2O 2000 _yssbyy_bn?nsn_yynnyn_ynyyny_ynyy??_sy?ynn_yynyny_nnnyyy_yyynyn_nyyyyy 2181720 M12 MnSO4 2000 _nsnnyy_nnnnbn_nnnynn_sbynnn_nnyn??_sn?nnn_nnnnnn_nnnnbn_nnnnsb_nnyyyn 108 218 M13 MnSO4 5000 _nynnnn_nnnnnn_nnnnnn_ynbnnn_nnbnnn_yn?nnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnbnnn ? ? M14 NiCl2.6H2O 10 _nnbnyn_nnnynn_nnnnnn_nnybnn_bnyb??_yy?nyn_ynnnnn_nnnnnn_nnbnnn_nbyybn 212 260 M15 PbAc 500 _ysyyys_ynyyyy_yyyyyn_yyyyyy_yyyy??_sy?sss_yyyyyy_ynnyyy_yyynyb_byyyyy 5681368 M16 SeO2 300 _yyybny_nnnnnn_snynsn_yynyny_nnny??_yy?byy_bybnyy_yynyyn_yyynbb_bynnby 16 292 M17 TlCl2 20 _nynnnn_nnnnny_nnnnnn_nnnnnn_ynnn??_nn?nnn_bnbnnb_nnnnyn_nnbbyb_nnnny? 11 28 M18 VO3NH4 2000 _nnnnyn_nnnnyn_nnnnyn_nnynnn_nnyn??_nn?nnn_ynynnn_nnnnnn_nnnnbn_nnyynn 80 520 M19 WO4Na2 2000 _sysnys_snsysn_sssnyn_snynny_ynyy??_yy?yyy_yyyyyy_ybnyyy_ynbnyb_byyyyy 2101048 M20 ZnSO4 20 _ysyyyy_yyyyyy_ynbnyn_snyyby_y?yy??_sy?yyn_yyyyny_bnnyyy_ybyyyy_yyyyyy 161 596 M21 MgSO4 2000 _ysyyyy_ynyyyn_sybnyn_snyyby_ybyy??_sy?yyy_ynyy?y_ynny?y_yyb?yy_y?yyyy 340 556 M24 KBr 1000 _ysyyys_ynyyyy_yygyyn_sbyyby_byyy??_sy?ssn_yyyyyy_yynyyy_yyynyy_yyyyny 2021656 M25 NaF 500 _ysysys_ynyysn_snbnsn_sbyyny_ybyy??_yy?yyy_yyyyyy_ynnyyy_ynyyyy_byyyyy 262 880 M26 HgCl2 1 _yyyyyy_ynyyyy_yybyyn_sbyyyy_byyy??_sy?yyy_yyyyyy_yynyyy_?ybyyy_yyyyyy 148 178 M27 K2SO4 5000 _ysyyyy_ynyysn_ynynyn_snsyny_ynyy??_sy?yyy_yyyyny_nnnyny_ybbnyy_nyy?y? 240 760 M29 TiO2 10000 _yyyyyy_ynyyyn_yyyyyb_syyyyy_bnyy??_sn?yyy_yyyyyy_ynnyyy_yyynyy_yyyyyy 87 576 N01-glutamate-L Na 谷氨酸钠 _yyyyyy_Ynyyyn_Nyyy?n_ynyyny_nnyy??_yynyyn_yyyyyy_yyyyyy_ynynyy_yyyy?? 39 680 N02-lysine-L 赖氨酸 _yyyNyy_Ynyyny_yNyn?y_ynynyy_nnyynn_ynnnyn_yynyny_yyyynn_ynynyy_yyyy?? 85 520 N03-proline-DL 铺氨酸 _yyyyyy_ynyyyN_yyyn?n_y?yyny_yyyynn_yyyyyy_yynyyy_yyyyyy_yyyyyy_yyyy?? 104 776 N04-serine-L 丝氨酸 _yyyyyy_ynyyyN_yyyy?y_yyyyny_nynynn_nynyyy_yyyyyy_yynyyy_ynyyyy_yyyy?? 571052 N05 tyrosine-D 酪氨酸 _yyyyyy_ynyyyn_yyyy?y_yyyy?y_nyyynn_yyyyyy_nynnyn_yynyyy_yyyyyy_yyyy??? 15? 0 R01 KI 200 _ynssys_ynsbyy_yyyysn_snnybn_nyyy??_sb?yyy_yyyyyy_ybnnnn_yybnby_yyyyyy 2941040 R02 NO3Na 2000 _yssyss_ynyyyn_ynyysn_snyyny_bnys??_sy?yyy_yyyyyy_ybnyyy_y?ynyn_yyyyyy 103 448 R03 NaCl 15000 _yybnyy_nnnbnn_ynbnbn_ynybnn_bnyn??_sb?nyn_yyyyny_nnnynn_nnbnyn_nnyyyy 166 876 R04 SDS 100 _ysyyyy_ynyyyb_yyyyyy_yyyyyy_bbyy??_sb?sss_yyyyyy_ybnyss_yybnyy_yyyyyy 132 780 R05 bromothymol blue 750溴麝香草酚蓝 _ssysny_ynynyn_sbyyyn_snnnny_nnnn??_sn?yyy_nsnyyy_yynyyn_nyynyn_nnnnnyB 1B472 R06 methylene blue 1000美蓝/亚基蓝 _nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnn??_nn?nnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn R07 congo red 3000刚果红 _syybyy_nybys?_ybnnyn_snbynb_bbyy??_sn?syy_yyyyyy_ybnyyy_ybynyy_yyyyyyB 43B528 R08 crystal violet 20结晶紫 _nnnnnn_nnnnnn_nnnnbn_bnnnnn_nnnn??_nn?nyn_nnnyny_nnnnnn_nnynnn_nnnnnn 4 5 R09 malachite green 20孔雀绿 _ysyynn_ynynbn_ynnnsn_snnynn_nnnn??_sn?yyb_nynyyy_nnnyby_ysynyn_n?nnyy 9 1 R10 nalidixic acid 50萘啶酮酸 _ysyyyy_ynbbyn_yybysn_sbyyny_byyy??_sn?ssn_nynyyy_synyyy_yyynnb_byyyyy 426 608 R11 nalidixic acid 200萘啶酮酸 _ysybyn_ynnysn_ynnbsn_ynynnn_yyyy??_sn?ssn_nynnyn_bynbyy_yynnny_yyyyyb 520 376 R12 berberine HCl 275黄连素 _ysnynn_nnnnnn_ynynnn_snnnnn_nnnn??_sn?yyn_nynynn_nnnnnn_nnynyb_nnnnnn ?1 ?4 R13 glucose 300000葡萄糖 _nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnn??_nn?nnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn 0 0 R15 pH 9.0 _ysyyyy_ynybyn_yynyyn_sbyyby_byyy??_sy?ssy_yyyyyy_ynnbyy_yyyyyy_yyyyyy 420 944 R16 pH 5.0 _nnnnyy_ynnnyn_nyyyyn_sbbnny_nbyy??_yn?yy?_ynyyyy_nnnnnn_nnnnyn_nnynnn 781586 T01 growth on Bernaerts lBenedict试剂 _nsynyn_ynyysn_yyyysy_syyyyy_yyyy??_sy?ssb_ysyyyy_synsys_ynysyy_ysyysn 842376 T02 growth on bromoth b20美蓝/亚甲蓝 _ssysns_snsnsn_ssysyn_synsby_nyny??_sn?sss_ysynyy_ynnyyy_nnny?y_ysnnsy 61 48 T03 growth at 4oC _n4n754_nnn49n_nn8nnn_9n6nnn_nn7n??_33?nnn_nnn3n3_nnnn9n_nnnn3n_nn86nn 16 724 T04 growth at 28oC on YMA _112231_4n321n_232n1n_152351_3622??_1n?312_111111_2nn313_3n1n13_532113 891000 T05 growth at 37oC on YMA _??????_??????_??????_??????_??????_11?32n_1n1n2n_nnn233_nn1n1n_n68n1n 292 856 T06 growth at 37oC on LB _3nnn3n_nnn1nn_3nnn1n_1nnnn1_1n4n??_n1?nnn_121nnn_nnn4nn_nn1n1n_nnnnnn 54 206 T07 TYtyrosine600CuSO4:40 _nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnn??_nn?nnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn 0 0 T08 Mg-free agar DM-Mg(Mn _nyyyny_yyyyyy_nnyn?y_ynyyyy_nnyn??_yn?yyn_y?y?ny_yy?yny_ynynyy_?yyy?? 27 800 T09 MnSO4 2000 at pH=5 _ysnnyy_ynnnyn_ybnynn_sbyyb?_nby???_yb?nyy_yyyyyy_ynnnyn_nnbnyb_ynyysy 164 660 T10 Onobrychis nodulation红豆草结瘤实验_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnn??_nn?nnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn T11 2 days at 37C _??????_??????_??????_??????_??????_??????_??????_??????_??????_?????? 210 544 T12 COLOR ON TO4ctd.nonrd _nnnnnn_nnnnnn_nnnnyn_nnnnny_nnnn??_nn?nnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn 39 100 T13 CuO2 rings on T1 _ynnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnnnn_nnnn??_nn?nnn_nnnnnn_ynnnnn_ynnnnn_nnnnnn NM0 YMA control _??????_?n?n??_??????_??????_??????_??????_??????_??????_??????_?????? 2483428 NM1 MILSOL*0.05 + YMA _??????_?n?n??_??????_???y?n_n??n??_?n??y?_n?n???_?y?n?y_?ny???_y????? 1803690 NM2 SELSOL*0.05 + YMA _??????_?n?n??_??????_???y?n_n??n??_?n??y?_n?n???_?y?y?y_?ny???_n????? 77 204 NM3 ethanolamine (=C09) _??????_?n?n??_??????_???n?n_n??n??_?n??n?_n?n???_?n?n?n_?ny???_n????? 164 0 NM4 tyrosine (=NO5) _??????_?n?y??_??????_???n?y_n??n??_?n??n?_n?n???_?n?n?n_?ny???_n????? 3081120 NM5 MILSOL*0.05 + C09 _??????_?n?n??_??????_???n?n_n??n??_?n??n?_n?n???_?n?n?n_?ny???_n????? 2321176 NM6 SELSOL*0.05 + C09 _??????_?n?n??_??????_???n?n_n??n??_?n??n?_n?n???_?n?n?n_?nn???_n????? 0 2 NM7 glucose 100000 _??????_?n?n??_??????_???n?n_n??n??_?n??n?_y?n???_?n?y?n_?nn???_n????? ? 680 z01 bromothymol blue 20 _s?ys?y_s?sys?_ss?s??_syssyy_?yss??_ssssss_ns?ysy_s??yns_ssby?s_yn???? 88 626 z02 chlaora+bromotbl+Co _??ny?n_s?nns?_sy?s??_synnbb_nynn??_snnssn_snnnsy_s??y?s_snbb?s_yynn??P 10 652 z03 pen+nal+bromot+bacitr _n?nn?n_s?nns?_sn?n??_snsnnn_nnnn??_snnssn_nnnnsn_n??n?n_ynnn?y_ynnn?? 5 45 z04 pen+bactitr _y?ny?b_y?yns?_by????_s?byyy_nynn??_syssss_nsnysy_y??y?n_yb?y?y_ynnn?? 31 208 z05 malg+bromot+Se+Co+ery _n?nn?n_n?nnn?_nn?n??_ynnbnn_nnnn??_nnnnsn_nnnnny_n??n?n_nnnn?n_nnnn?? 0 0 z06 malg+bromot+Se+Co+bac _n?nn?n_s?nnn?_nn?n??_bnnnnn_nnnn??_nnnnsn_nsnnny_n??n?n_bnnn?n_nnnn?? 1 3 z07 erythritol _n?ns?y_n?nbs?_nn?b??_bbbbbb_bbnb??_bbbssy_nynbby_y??y?n_nnys?y_yyyy?? 18 482 z08 lactate (pH=8.5) _n?ny?n_y?yyn?_nn?n??_ynnnny_nnyn??_??????_??????_??????_??????_?????? 192 708 z09 melezitose _n?ny?n_y?bbs?_ny?y??_sbbbbb_bbbb??_sbbsys_bbbbbb_s??s?s_bbbb?s_bbnb?? 100 434 z10 sorbose _n?nn?n_n?nby?_nn?b??_bnnbnb_nnnn??_??????_??????_??????_??????_?????? 12 6 z11 lactate+chlora+bro+Co _y?nb?n_y?nbb?_yy?y??_bbnnnn_bnnn??_nnnnsn_nsnnyy_s??b?n_snns?b_bbnn?? 3 430 z12 YMA _s?ys?s_s?sbs?_ss????_sysssy_?ysy??_ssysss_bybbyb_s??s?s_yyby?y_y?ss?? 481380 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 备注: 本表检验数据列出的60个菌株(其中54个保括在分析内)从作到右排列与表T-4.1-A的从上望下排列一样. "S","B","Y","N","?"意义见第4.1.7节. NM1-NM7及Z01-Z12不包括在数值分类之内,其讨论见第5章."成"和"草"是接种成都土壤和草原土壤的对照倒板上生长的菌落数量. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
4.2.1. 微生物生长:：随机选取(第4.1.4节)剩的在-10C保存在小瓶中的菌液; 挑取一环接种到平板上;倒培养基;观察菌落数量。在19号,30号,9号及27号菌株中分别检测到12,5,5,和2个菌落.因为经过冰冻处理,注皿损失较大,作者估计每次点样时细菌数量大致在10-100之间. 然而,我发现不同的菌株阳性率有很大的波动幅度(0.07-0.85).即使将阳性率低于0.20(8和41号)和高于0.80(49和18号)的菌株去除,留下菌珠的阳性率范围(0.21-0.79)还是相当宽.
4.2.2. 计算时间: 用我们的数据,PROG_CLU.C在586机上需要5分种,在386机上需要5个小时.
4.2.3. 用非活力的相似系数: 相似系数的选择具有很大的影响,特别是对树的下面的分支.如果用简单匹配系数(#SNEATH 1973)钏淙挥行┐(44-52-7-9),(37-42-1-34)及(19-25-17-22)表现比较明显(见图D-4.2-A);但整个树混有对照非根瘤菌(如23;47;12),换句话来说,高等系统发育比较模糊.如果采取阳性匹配系数(#SNEATH 1957;D-4.2-B)整个树变得"链型"一些,但总的变化不大.
4.2.4. 用SNEATH#(1968)的非活力匹配的相似系数: 现在对照菌与根瘤菌水火不容;但树的结链现象还是严重(比如慢生根瘤菌簇,原19;25;23;22;51;17,全然不见).一个FARRIS-WAGNER树中(D-4.2-D)也有两个比较明显的根瘤菌簇,但是仍无法分清豌豆根瘤菌和慢生根瘤菌.
4.2.5. 用卡方为基础的相似系数: 用纯卡方系数进行聚类,树的链性减少了,快生根瘤菌簇也不错,但慢生根瘤菌倘未聚在一起 (D-4.2-E). 全修正后的卡方又产生D-4.2-C的结果(豌豆-慢生根瘤菌混着在一起).通过半修正的卡方得了比较好的种簇(D-4.2-G).如果不算所有菌株一律为阴性的检验而把活力差距(DV)限制到0.30以内可以再优化这个树(D-4.2-H).如果排除菌株39的数据,树修正得更"漂亮"(D-4.2-I). D-4.2-J是在于D-4.2-G相同的条件下产生的,但只考虑了C/N源利用能力的数据,完全无视耐性数据.
------------------------------------------------------------------------------------------------------- 表 T-4.2-B: 若干相似性所产生的最大族 -------------------------------------------------------------------------------------------------------- Coefficient Diagram Vetches Bradyrhizobia Sinorhizobia Xiaman-huakuii rhizobia Contr. Simple matching D-4.2-A 37-43-14-16 17-22 + 19-25 3-42-1-34 44-52-9-7 3 Positive match. D-4.2-B 37-43-14-16 50-51 + 19-25 1-34-3-42 44-52-7-9 4 Match w/o vigor D-4.2-C dispersed + 19-25 1-34-46 3-17-42-45-44-7-18-30-9 0 ibd.Wagner/Farr D-4.2-D 39-14-43 + dispersed 1-13--34 + 42-46-27-3-52-45 5 Chisquare coeff D-4.2-E 14-37-16-43 19-22-25 3-42-1-34 44-52-7-9 2 Modif Chisquare D-4.2-F 14-16 + 19-50 1-34 dispersed 1 Semimodif chisq D-4.2-G 16-37-14-43 50-51-22 27-46-13-1-34 7-30-9-31(?)-44-52-3-42 2 *w/o inv,vig<.3 D-4.2-H 16-37-14-43 19-50-25-22 13-1-34-27-46 9-30-7-31(?)-42-3-44-52 1 ** w/o 39 D-4.2-I 16-37-14-43-32-40 19-25-50-51+17-22 1-34-13-46-27 9-30-7-31(?)-44-52-45-42-3 1 C/N utiliz. D-4.2-J 19-21-50 + 14-16 7-34-27--3-31 44-52 -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 备注: "Contr." 是"污染"包括所有的根瘤模式菌的树的部分. --------------------------------------------------------------------------------------------------------
4.2.6. 根瘤菌分类学:不同的方法得了不同质量的分簇(T-4.2-B),我们认为图D-4.2-I比较接近自然分类,有一个中心(16-37-14-43)很清楚的豌豆簇(16-37-14-43--32-40), 一个比较模糊的慢生根瘤菌簇(19-22-25-50-51-17),一个中华根瘤菌簇(13-1-34-27-46),它有时与辖曼-华癸簇(9-30-7-31-44-52-45)混合.(3-42)这个密切的小组有时为中华簇的一部分,有时与华癸簇接得近,但难以给出确切结果.没有接近山羊豆根瘤菌(29)的模式菌株的菌株可以肯定.所用的百脉根根瘤菌株很可能被污染,因其不接近任何其它的模式根瘤菌.有关(39)没有任何明确结论.菌株(2;4;6;28--15;12;48;49;36;38;11;54;5;26;20;53)叫冰箱簇(不是根瘤菌).其中亲缘关系密切的(5/6-20-26-53-54)的亚簇("树枝")具有培养两周以后菌落变成粉红色的共同特点,它们是从长期(几个月)用液体石腊在4C下保存的辖曼根瘤中分离出来的.
-------------------------------------------------------------
表 T-4.2-C: 分开不同族的特征
--------------------------------------------------------------
medium Xiaman-huakuii vs. vetch
5000ppm K2SO4 (7/7) (1/6)
citrate as C source (6/7) (0/6)
2000ppm MnSO4;pH5 (0/7) (5/6)
Sinorhizobium vs. Xiaman-huakuii
50ppm erythromycin (5/5) (2/7)
citrate as C source (0/5) (6/7)
tartrate as C source (1/5) (7/7)
rhizobia vs. freezer bacteria
growth at 4oC (1/22) (14/15)
-------------------------------------------------------------
4.2.7.有关快生根瘤菌多样性的试验:在选择培养基中A02,A03,C06,N02,T08,T09较为理想,阳性菌株比例40-60%;C02,M04的选择性稍差(阳性菌株60-70%) ,C02,M04,C16,C30,M09.M11.M20,M21,M27,R07为70-80%;C05,R03,R16特异性稍强(阳性菌株30-40%):;C03,M14,R12.为20-30%;在T10没有任何菌株或土样结瘤. 虽然没有多少作者列出他们的检验的信息含量,这以为在许多情况下高温灭菌没影响选择性试剂的分辩能力.如果把我们的结果与已发表的模式菌的描写比较的话,直接可以比较的检验的结果当中7/8符合天山根瘤菌(#陈1995),5/5符合山羊豆根瘤菌(#LINDSTROEM 1989),6/8符合佛雷蒂中华根瘤菌(#SCHOLLA 1984)8,8/10符合热带根瘤菌(#MARTINEZ-ROMERO 1991)嗪13/20符合华癸根瘤菌(#陈1991)Z.
4.2.8. 生物检验的分类 : 通过全修正卡方所得的聚类最为可信(D-4.2-K):早期成对聚类当中有:Cr3+及NaCl耐性,FeAc及NiCl2耐性,MnSO4(2000)在pH=5及pH=7耐性,K2SO4耐性及LB培养基上的生长,对于溴麝香草酚蓝及孔雀绿的耐性,丙二酸和核黄素的利用,丙酸和酒石酸的利用,柠檬酸的利用和无镁培养基上的生长,苹果酸的利用和在4C的生长,对50及200PPM萘啶酮酸的耐性,对于黄莲素的耐性及蒽酮的利用.
4.2.9. 平板设计的可行性: 虽然为了点稀释液体的根瘤菌(第4.1.4节),每张平板不得不打开,关闭30次,污染菌比较罕见.因为上述的聚类结果还算令人满意,好象点在7-10MM为距离的不同种的菌落无互相影响.最少九天以内一种菌落覆盖另一种的现象比较少(5400个数据当中不到20个).
4.3.1. 普通微生物学方法: 采用平板法用的玻璃器皿少.我们觉得不同菌株之间生长力差异主要来自点到平板的细菌数量不一致,因此首先需保证所点的细菌数量较为一致;进行重复实验也是必要的;另外,对数据的不同分析方法也会导致结果差异.本文所采用的方法较为适宜.
4.3.2. 设计一个更健全的相似系数: 为了优化相关系数采用UPGMA比WAGNER-FARRIS运算方便,因为采取前者的时候几步聚类以后即可以评价其可信度.有的作者(如#NOVIKOVA 1994)龈久凰邓堑南喙叵凳窃跹愠龅.在生长力不同的条件下简单匹配系数不可靠.比如#徐(1995) 证明特别慢生根瘤菌的独特性的时候,他也采用多种的方法(G/C含量,DNA-DNA杂交,血清学,16 S rRNA定序等).在本调查因活力差距大,简单或正匹配相似系数就不合理.
-------------------------------------------------------------------------------
表 T-4.3-A: 相似性系数
--------------------------------------------------------------------------------
Simple matching (a+d)/n
Positive matching a/(b+c+d)
#Sneath 1968 -(b*c)/(n*n)
Chisquare square((a*d)-(b*c)-0.5*n)*n/((a+b)*(d+b)*(a+c)*(d+c))
modified Chisquare (if, for instance, a < d and b < c)
(a-1)/(b*b)-(b-1)/(a*a)-2/(a*b)
semimodified Chisquare (if, for instance, a < d and b < c)
square((a*(a+d))-(b*(b+c))-0.5*(3a+3b+c+d))*(3a+3b+c+d)/
((2a+2b)*(a+d+2b)*(2a+b+c)*(a+b+c+d))
--------------------------------------------------------------------------------
Note: simplified for those parts relevant for relative similarity
n: Total number of biological tests for which data for both strains are available
Contingency table for both strains:
a: both strains +, b: strain 1 + & strain 2-, c: strain 1- & strain 2+, d: both strains -
S: similarity coefficient
--------------------------------------------------------------------------------
由#SNEATH(1968)4所提出的排除活力的相似系数,对于比较远(高等分类群)的分辩极为有效(所有的预知的对照菌和根瘤菌区别明显).但是阳性或简单匹配系数与排除活力的概念有一个比较大的区别:前者不受阳性,阴性检验数字的影响;而后者受影响.我们数据当中阳性和阴性检验差距很大,具有很多阳性(或阴性)的数据的菌株的聚类比阴阳各算一半的菌株容易得多,因为如果阳性(或阴性)数据占优势,联列表中B*C变得小.其具体结果是这时豌豆簇突然消失了.
在这种情况下,我们认为如果在联列表A和D的数值接近的话(就是说两个菌株共亨许多阳性和阴性的特点),那这一对菌株比一个只有阳性检验或者只有阴性检验的对还是接近一些.
#SNEATH(1968)所提出的算法的弱点在于它放弃所有有关A和D的比例的信息.
分析联列表的很常见的方法是卡方检验(为倘未明的原因在聚类分析用的少,比如#钟1990没提到).为了保留相似性在0-1的范围之间,我们设相似性=卡方/(卡方+1),这个定义虽然没有任何理论上的"意义",但是这样容许继续用与其它的相似性系数同样的方法,而这样所设定的函数在所有的可得到的卡方范围之内满足严格单调性的要求.如所预料,此刺激了阴阳个算50%的对(其所UPGMA选择的A*D值特别高)聚类.虽然这样又得了一个比较漂亮的豌豆簇,但其它簇及高等分类群又比SNEATH(1968)系数模糊.
为了把这个方法再变得更"保守"一点,我们就认为在联列表只管最小的数值(在联列表这就说A和D及B和C各对的最高值所最低值被代替),这样可以给算法一些SNEATH1968系数的特征;它也强烈选择小的B*C.然而,这次改正又过份,因此设计了一种"半修正"的卡方让联列表的A和D及B和C各对的最高值所平均值取代.
所产生的算法就要求A和D都应该比较高,稍微偏向A及D相似的情况,而这好象在一个活力相差比较大的生物的数据分析结果,无论在高等分类群水平还是在低等分类群水平都比较理想.
然而,在容许更大活力差距的聚类当中(如4.2.8.),在低水平分类中,全变卡方比它强烈.因为当前表型的分类在细菌分类是一个相当沉默的领域,可以证明全修正及半修正卡方在更"先进"数据的处理时更有,比如在所分离DNA质量不一致基因指纹法等.
4.3.3. 树的可塑性: 当前分类学的主流是发表一个通过一种方法得到最简便的树.这虽然比较客观(因为是预先确定的),有时可能不符合数据的多样性.并且最小演化论比较适合与随机的序列变化,但不一定适合与微生物生长数据.MAYR(见FELSENSTEIN 1982)曾经认为,,如有那么多比较好的树,虽然得到一个可靠的演化树"何必非要不可得到最节约的那一个?".当然可以批评我采取的注释学方法是主观的,但是该强调的是我找一个比较好的树主要有两个道理:(一)对照菌不该和根瘤菌模式株混在一起(二)慢生根瘤菌(带三个已知的菌株)应该密切聚类在一起.因为本实验的设计故意略了一些有的作者描写为分开快生和慢生根瘤菌的检验(常见有麦芽糖,肌醇,乳糖,纤维二糖,棉子糖和蔗糖,见DATASET.TAX;本实验其中只用了前三者)而生长速度每算成特征(请比较#NOVIKOVA 1994,她把生长速度加重为5个单独的特征).而且对于草原根瘤菌没有了任何偏见,而且我们感到证实那个未预料的冰箱细菌而根瘤菌之间的区别多么明显(除非一株以外没有一个根瘤菌在4C生长,除非一株以外所有的在树的低部的冰箱菌都在冰箱生长).因为本实验大量用盐的耐性为了对照我们也作了一个只用C/N利用数据的树(D-4.2-J).因为放弃了数据的多半,当然树看起来又比较乱,只有其基本特征(原有簇的大部,根瘤菌/对照菌的分开仍然保留.
我们基本上认为所有的树是同样的分类学角度(如#MANNETJE 1967),但是为了想看到"最终结论"的研究者造了一个:如果限制活力差距在0.3以内而无视所有的菌株一律为阴性的检验就获得树(D-4.2-H);如果再无视(39;来自根瘤细小的成都三叶草),它所引起的分枝立即崩溃而所有的其余菌株会占可预料的位置(D-4.2-I).
4.3.4. 所得到的认为的接种族及对于草原根瘤菌技术实用影响:黄龙寺豌豆根瘤菌与成都豌豆根瘤菌接近,只有一个来自胡卢巴的菌株(32)比较例外(因为许多作者,比如#FRED 1932一般认为胡芦巴致瘤的是中华根瘤菌),但是因为本菌株拷贝了几次不能完全排除交叉污染,说明胡芦巴真正很特殊这需要更多的菌株以证明.
以前我已经提到了幼嫩的红豆草结瘤比较差(而植物成株上的根瘤多半未绿色).虽然早期的工作者如#MUELLER 1925和#FRED 1932一般把红豆草归纳到一个独立的接种组,有时红豆草根瘤菌也是与中华根瘤菌接的较近(比如#PREVOST 1987).我们研究当中与苜蓿中华根瘤菌模式菌株最接近的是一个红豆草根瘤菌,而且本菌株是唯一的来自以前接过种的辖曼的样方(第3.1.4节):接种液体当中也有了野生黄龙寺苜蓿的菌株.
因为(3-42)小组包括中华根瘤菌的一个模式菌株,而(3)很可能来自苜蓿,可以试图把它们联到其余中华根瘤菌簇,但是有的苜蓿根瘤菌与天山根瘤菌及夫雷蒂中华根瘤菌比苜蓿根瘤菌的模式菌株更近.
其余的红豆草根瘤菌与野生黄芪根瘤菌和(来自黄芪属的)紫云英.黄芪根瘤菌形成多样性很大的族(#WILSON和CHIN 1947).热带根瘤菌也参与这个簇比较奇怪0,也许是由强的离子耐性趋同进化而产生的).在加拿大的相似的环境中,#PREVOST 1987说明栽培的红豆草能够利用野生黄芪及棘豆的根瘤菌(作为一个共同的簇).我们分离的根瘤菌与加拿大的根瘤菌区别在于4C下九天之内没有生长.虽然有这种区别,#NOVIKOVA(1993,1994)也证明了一个比较大的温带根瘤菌的共同簇的存在(包括山豆总属如黄芪属,棘豆属,甘草属)和岩黄芪总属(岩黄芪属,红豆草属)而好象在辖曼自然环境情况总也是如此.
如果我们临时接收这些假设(当然最好确认以更多的菌株;不同的分类学方法等),此说明自然辖曼牧场土壤中中华根瘤菌不多而用中华根瘤菌接种的话可以引起红豆草共生细菌的改变(当然完全不明此改变是好转还是恶转).当然,其它的可考虑的菌株是不同的野生黄芪,特别是因为野生豆科植物调查阐明了所形成的根瘤质量相差比较大.
4.3.5. 根瘤菌生物学: 生物检验的分类引起Fe2+及Ni2+(离子直经相似),短碳酸的吸收机制相似,能够"利用柠檬酸为唯一碳源"实际上是一种能够耐所这个蟹合剂而引起二价离子的乱调的能力等结论.
诚然,也有的结合是又非根瘤菌较多而伪造的,比如Cr3+和NaCl的结合.结合大部也是作过培养基两批(第4.1.4节)的一个批内的,第一个例外(来自两个不同的批的培养基结合)是两个多环芳:黄莲素耐性及蒽酮的利用.
虽然有人可能认为以提议这些比较大胆的结论依靠的数据量太小,我们提出这些例子主要目的是方法学:
根瘤菌数值分类学的数据完全可以再利用以更了解哪些生物学特征相关,这样会得到为了了解根瘤菌的生物学新的问题而新的研究启发.
如果可以比较几个不同作者的研究结果,这当然更有意义.为了保证后代工作者有这种机会,也许最好听#SNEATH(1957:193)的话:"显示检验结果的最好方法是把整个数据表(每个菌株的每个检验)都发表".遗憾的是以前平常不能这样作,但是九十年代数据保存及网络资源那么便宜,这基本上不会再存在多大问题.