1. 综 述
摘要：本 文 对胜利学,辖曼实验 场 的 生 态 条
件,固氮生态学和研究方法 进 行 了 系 统 的 介 绍， 以 及 论 文 的 立
题 基 础 作 了 说 明.
氮，弟七号元素元素不，为在我们的行星上迄今为止所发现的生命是一不可少的元素，它比如说是所有的带遗传信息的高分子（无论是脱氧核糖核酸还是核蛋白质）的成份。不巧,在最进二十亿年占上风的氧化气候中，氮的大部分位二氮气状态飘在大气层中，生物大部无法直接利用。虽然N-N键比较牢固，但不少分散者在原始，，真细菌两国的生物（#WOESE 1987）并行地得到了固氮能力，有可能是经过横向遗传传递（#POSTGATE 1992）。固氮，这就是大气中的氮通过氢连接到碳连接氮的转化是经过固氮酶进行的，不久有人把它的氨基酸序列完全发表了。他所几种Fe/S丛，一个ATP反应位置和一个负责二氮的连接及还原的钼部而组成。因为活化反应中心需要氢阴离子，该反应的不可避免的负产物是氢（它也许带保护氧敏感的固氮酶的好处）。根瘤菌有独特的再循环系统。值得注意，有人认为非钼辅酶（如固氮菌的钒/铁辅酶）因大量释放氢而效应比较差（#FRAUSTO 1993：426）。
当然，俘获大气中的氧气这种机敏的道路并不免费,反之该花 五牛 二 虎 之力。#Rao(1987:247)估计把一每摩尔氮插入到碳骨架上，必需消耗在1.26-1.6mol之间的葡萄糖。但是,当比拟还原硝酸盐而上之到碳骨架的费用(每氮的mol固定消费需1.4-1.5mol葡萄糖)乃至氨的同化作用(也消费0.7-0.8mol大半用为了与碳骨架结合)，并不那么吓人。从经济角度来看，世界上每年大概为1500-1750亿公斤按成都尿素价值来运算值1。2-1。4兆 元。
因为它们的用处那么大，固氮生物平常参加共生如佛兰克氏防线菌在许多木质高等植物（#BENSON 1993，#中科院林业研究所1985，#邓1992），蓝细菌在地衣或者在水稻田的细小的AZOLLA上或者在牛瘤胃固氮菌。这些共生当中研究最深是豆科植物-根瘤菌的共生，下面解释。
豆科植物是双子叶植物的科（或者总科），按物种多样性是地球上的第三大科（地球高等植物生物多样性的5；禾本科（7%）与兰科（7%）之后。它们占世界高等植物生物量的1%以上。由于包括如黄豆，绿豆，蚕豆，四季豆，花生，豌豆等常见作物及三叶草，红豆草，胡芦巴，野豌豆等重要饲料，它们对于人类营养来说（禾本科之后）占第二位（#ALLEN 1981；#BISBY 1996； 网络上的数据库在 www.soton.ac.uk/~ildis).虽然“绿色革命”豆科育种的进步次于有人工栽培历史5000年的禾本科；现在又赞成为可持续性农业的好工具（#GILLER 1996）。
土壤总是微生物最丰富的生境，根瘤菌亦不例外，虽然它们的数目一般比较低。固氮菌能源消耗大，所以周围植物的根的区域（“根围”，#焉1993，#DOEBEREINER 1988）特有吸引力，所以根是细菌接触得最容易的植物器官。根据系统发育学（它们在ALPHA-变型[=紫色]纲，#STACKEBRANDT 1988）它们相似与线粒体，PHYLLOBACTERIUM，土壤菌等原来是一种植物病原菌，但因为其固氮能力有用逐渐得了豆科植物的欢迎。
共生限 于 植 物 中一特别的器官，欧洲语言一般叫（"nodule"/="小节"）,中文叫"根瘤",意味着此反映亚洲传统作物大豆的根瘤是"瘤 状"的;温带许多作物的根瘤是"节 状"的.如说到东方-西方的根瘤学,还不得不提到有一种模糊的假说认为在古代汉字"豆"包括的三点指示不规则的球粒(#Hymowitz1970,#Bergersen1980:2),如果那个理论有道理的话,那东方发现根瘤就比西方(Fuchs1542)早两千多载.不过,此假说目前在国内没有多少人相信(请自己在图书馆试查Hymowitz的文章).
很长时间,人家都认为根瘤菌在根瘤内才有固氮能力,而在1975年#PAGAN才证明了在无氮而无豆科植物的培养基上也能够进行固氮。虽然其他的作者（如#DREYFUS 1983）也证实了独立的固氮能力广泛，但我们迄今还是认为固氮的大部分是在更复杂的根瘤系统内。
第19世纪的“微生物猎人”还根本不知道根瘤菌有何用处的时候已经开始分类（#Schroeter1886,见#Moffett1968)6. 自发现固氮能力（典性的报告是#Hellriegel和Willfarth1888)＃头⑾至瞬⒉ 是每种细菌 都能够与每种植物形成根瘤。这样就逐渐提出了十来个“结瘤族”（#MUELLER 1925，#FRED 1932）。来自同样族的菌株能够互相替换与某（些）种植物结瘤的根瘤菌，但来自不同族的菌族就不能互相替换。比如说，豌豆，蚕豆与野豌豆根瘤菌在同一个族，而如果你从蚕豆分离一种根瘤菌，你可以用它结瘤其它的蚕豆或者野豌豆（成都话：“苕子”），但与黄豆就无法结瘤。提个比方：中国人看得懂中文的书（无论出版社在哈尔滨还是海口），日本人会看日文书（无论来自北海道还是绳岛），但你也知道这个相关不是完全的:相当多中国的会日文，会中文的日本人也不少而相反在中国还有中文并不是母语的数千万人，在日本还有母语并不是日语的数十万人。上述的相关（虽然很实用的）是有限的，而根瘤菌互接种组也是这样，有的界限比较确定（如豌豆族或苜蓿族），有的界限有点糊涂；其实用不到象研究黄芪根瘤菌而叫它的文章“放弃互接种组的500多原因”的#WILSON（1944）那么玩世不恭。
与上段不同，植物-细菌 共 生 方 式的详细 讨 论对了解本论文不重要，但是这个很有趣的共生协调值得介绍一下：(1)如果缺氮的话（#CORONADO 1996）豆科植物产生类黄酮,这些类黄酮从根排出到根际.(2)土壤里类黄酮被分散,如果碰到自由的根瘤菌,根瘤菌可以分解类黄酮经过C环分解(#RAO和COOPER 1994).虽然现在还没有弄清楚结瘤基因表达的引物是类黄酮或者其分解物,结瘤 nod 基因当中表达最早的是nodD(各种根瘤菌有nodD（#谭和陈1992）,但是按结瘤组不同,#SPAINK 1994)1,它所产生的NodD 蛋白质开始调控各种结瘤基因,(3)其中最重要的是NodABC(各种根瘤菌公有的,覃和陈1992). NodABC的能够产生Nod因子的骨架,Nod因子的功能是使植物形成根瘤.NodC的核苷酸序列相几丁质合成酶,它很可能催化N-乙酰-D-葡萄糖胺单位的多聚. 建好了几丁质四五聚物以后,NodB脱其顶端的N-乙酰-葡萄糖的乙酰基,而后NodA催化另外的(长一点) 的酰基的结合(#DENARIE 1993)9.虽然根瘤菌会分泌Nod因子到培养基,从它的化学结构来讲Nod因子的原位很可能在根瘤菌的细胞膜(#HIRSCH 1992)).每种根瘤菌的Nod 因素的化学结构不一样,接瘤范围比较宽的菌株(如NGR 234)有几种Nod因子.化学结构弄清楚最早的是苜蓿根瘤菌的Nod因子(#LEROUGE等1990)9.除非共同的nodABCD 的基因以外,很多其它的结瘤基因提出寄主专一性,比如苜蓿根瘤菌的NodH,NodP及 NodQ负责给Nod因子转移硫酸,NodE,NodF和NodL很可能参加与脂酸残基的合成(#CAETANO-ANOLLES和GRESSHOFF 1991).缺乏NodH的苜蓿根瘤菌的Nod因子缺乏硫酸,因此它们不能够再和苜蓿结瘤,但是突然能够感染豌豆组的豌豆(#HORVATH等1986, #DENARIE和CULLIMORE 1993)F.
如果Nod因子在毫微或微微克分子浓度碰到植物的根,最典型的反应是:(4)首先根瘤菌的根钙黏附蛋白(RHICADHESIN)连上植物的受体(#SMIT
1987)U,各种根瘤菌及土壤杆菌都有.根钙黏附蛋白的受体有可能是一个有Arg-Gly-Asp结合区的糖蛋白,发现这个结构的研究组认为是凝集素(#SWART等1994)L . 但是如果使用
BARONDES(1988)的那个广义的凝集素概念, 这个糖蛋白也许包括在内.
值得注意,
那个Arg-Gly-Asp受体结构除非在类VIBRONECTIN在DISCOIDIN这个凝集素也有分布.
根瘤菌和根的物理学连接(吸附)和pH, 钙 , 镁及磷有关 ( #CAETANO- ANOLLES 等 1989,#HOWIESON等1993)S. ( 5)
根瘤菌用纤维连根毛而接种后 6- 18 小时根毛卷起来(#HIRSCH
1992)9,(6)以后在根毛形成感染丝管.(7)细菌经过感染丝道到根皮,
使根皮细胞反分化和分裂成一个新的分生组织.
有人认为这个步骤需要根瘤菌的胞外多聚糖,但机制毫不清楚,概念模糊.(8)后者经过植物生长素运输抑制因子(
#HIRSCH
1989)产生根瘤,一种新的器官.譬如说,苜蓿的根瘤顶端有分生组织,中间有新感染区和包含根瘤菌类菌体固氮区及维管束.后者保持与寄主植物的新陈代谢.(9)
为了提供足够的氧气,植物合成豆血红蛋白,植物另外提供尿酸酶,
蔗糖合成酶及周围类菌体膜的蛋白(#CAETANO-ANOLLES和GRESSHOFF
1991).(10) 寄主植物最终控制根瘤总数的多少.#NUTMAN(1952)L发现了如果切除红三叶的根瘤的话,它会重新结瘤,不切除的话,就不会重新结瘤.以后别人在其它植物上也发现了类似的功能,
但是其分子
水平上的机制尚未阐明.
青藏高原（包括几乎整个西藏，整个青海，新疆，甘肃，四川的部分及毗邻国家的山区地带）是世界上最大的高原，对于东亚气候有巨大的影象。但它虽然是地理、文化上一片比较统一的地带，忧郁干湿度不同，其植被带很明显：东南有针叶林-西北有沙漠。咱们的研究地区在那曲-玉树半润湿地带（比有名的拉萨灌木草原稍微冷而润湿），请评赏以下#郑(1979)嗟姆浅Ｌ械拿枋:
"本地带位于青藏高原的中东部,从怒江河源的那曲向东经玉树、 果洛至川西北的若尔盖.地面割切较浅,多宽谷、盆地和缓丘,海拔4,000-4,600米, 东部若尔盖较低,约3,500米左右.冰缘地貌发育,有岛状冻土区存在.最暖月均温6-10(12)C, 年降水量400-700毫米,干燥度0.8-1.5,暖期多冰雹、东春积雪也不少.由小蒿草、蓼、 柳及杜鹃等的高寒草甸和灌丛是占优势植被,发育者草毡土和棕毡土.成土过程的主要特点是腐殖质大量聚积、淋溶作用轻微、长期融冻有重要影响. 土壤具坚实草皮层,滑塌、泥流等现象显著.河汊、曲流发育,河滩低地分布着...沼泽草甸."
高原大部分是所藏族牧民用为放牧的（#MILLER 1990），而有人 认为放牧制度的市场经济化带来的畜牧量的增加在某些地带引起了草原破坏：譬如在青海省1950年平均每羊单位占有可利用草地27.44亩,1985年降为11.81亩(在内蒙古,相当的数字是75亩(1949) , 24 亩(1979),13.9亩(1984),(许1990),有的县草原退化面积大于86%,孙1989). 因为过度放牧,整个青海省的天然草场产草量比50年代下降了30-60%,牛的体重下降30% 以上(安照1976年到1987年的统计)而从1959年到1977年青海省每年沙增加率为1. 8%.还有,如果过度放牧,草原生物量不但降低,而且植物组成发生化:在青海海北草原站的放藏系绵羊试验表明,如果把放牧密度提高从2.14只到6.07只/HA, 草甸中的杂草比例从21.7%提高到61.6%,有毒性草的比例从0.57%到1.39%(韩等1991).
另外，虽然几乎没受到多少污染，高原可能遭到会全球变暖的影响：一项由中国气象局-WWF进行的研究预料该环境在下个世纪末期之间减少为28%（一个1992年的估计，见#冯和王1996）。
青藏高原东中部的青藏(赵等1982)、甘(云等1994)而特别是川西(齐1960,柴等1963,,1965,祖1983,杨1986,孙等1987,TSUZUYAKI等1990、1992, BJOERK 1993, 杨和堇1993A-B,#赵 1995&1996)的沼泽区已经大量刺激了科学的重视, 所以有关沼泽发育的气候条件和植被的资料丰富,但是有关其它的植被类(如丘陵上的亚高草甸) 的研究好象还是比较少(刘1984,倪和魏1984,杨1987,陈1992,张1994，刘1994). 有关辖曼的植被最齐全的报告见#魏泰昌和赵佐成1986；一个（主要是他们的）高等植物及脊椎动物的种类目录见XIAPLANT。ALL（在磁盘上）。
若尔盖高原(亦称松潘草地)是一个被4000米左右的高山环绕成一个完成的山原,
南北最长有200公里,东西最长约100公里,山原平均海拔在3400M以上.区内岩层较为单一,主要是三迭纪灰绿色或黄色砂岩(多已变质变成板岩或千枚岩)
和黑褐色页岩互层,夹有博层灰岩.区边介于山原有低山(3700-3400M),比高300-500M,但是区内的丘陵一般比高只70-150M,少数为200-300M,大致与构造线平行.丘陵的东南坡一般较陡,留的古冰斗较完成;西北破因与岩层层面一致,比较和缓
.该区的河谷十分开阔(在黑河下游达18KM),沉积物深厚,在伏流和闭流地区平常形成湖群和洼地(柴等1965)
.
若尔盖高原气候冬春虽然降水量不多,但比青藏高原的中西部润湿:冬天的气候为半干,5月的气候为半润湿.夏秋天欣赏自印度洋和南海洋来的季风:6月到10
月份算为润湿,安照Penman公式年干燥度小于1(0.93),因此还是属于润湿地区(钱和林1965),所以该区的返青期、枯黄期比青藏高原其余地方早(张谊光1985).
但是若尔盖高原的北部比南部明显地干燥,具体的测试的数据如下:在最润湿的龙日坝年全年降水量为862毫米(柴和金1963),在红原县城753毫米(86.7%从5月到10月份,
根据红原气象站1961-1980年的数据,见秦等1985,降水变率中等(比如1956年为805毫米,1957年为613毫米,徐1960),在唐克为647毫米(柴和金1963),在若尔盖县城为657毫米(民政部1993)而在甘肃的玛曲县为616毫米(云1994).
因为若尔盖高原的气候站都位于高度几乎同样的平原, 所有报到的温度到处都差不多:年平均气温在龙日坝为1.0C(柴和金1963),在红原为1.1C(秦等1985),在唐克为0.8C(柴和金1963),在若尔盖县城为0.9C(民政部1993)而在玛曲为1.1C(云1994). 本区红原草原粘的气候数据发表了比较多,在红原县城七月份的平均气温10.9C, 日夜幅度猛烈(16.1C),每年晒太阳有2417小时,生长时期的光合有效光照5-8月为每月31000 J/CM2，9-10月为每月22000 J/CM2，其中光合作用用的比例不到1%,每年同化生物量平常达2000-3000KG/HA.沼泽土壤在深度5CM的平均温度五月为5。9C，七月为13。6C，九月为9。3C。土地10月份到5月份霜。冻结冻厚度二月份达40公分(洼地)及60公分(草地)(杨和槿1993A).
土壤受很大水文的影响,安照诊断特性为基础的新的中国土壤学(高1990；但土壤分类系统正在改变：王1994) 主要可以分三种土壤和植被(柴等1965):
(一)有机土纲的泥炭土:主要分布在黑河,少部在白河的宽的河谷中,在这儿常年,季节性或临时性积水(5-40CM).地表起伏不平,有各种形状的草丘. 母质多为粉沙和亚粘土.沼泽土尼炭累积较厚,一般为3米左右可以达6米.有机质含量一般大于50%, 全氮含量5-8%,pH为7.0-7.8.如果在介地地带泥炭层较博(50CM以下),可以呈为泥炭潜育土.根据杨和堇(1993B),最少(一/一)和(一/二) 群体的营养成份和营养成份动态接近,粗蛋白最高时期一律在六月份、生物量的高峰时期多半是在七月末.干生物量最大的是乌拉苔草甸(1650KG/HA),次是木里苔草甸和藏蒿草甸(1500KG/HA, 但是藏蒿草甸的干生物量高峰期才在八月初).
(一/一)常年潮湿的沼泽上代表性的植物有:Equisetum limosum,Potamogetum, Hippuris vulgaris, Myriophyllum spicatum, Cicuta virosa, Menyanthes trifoliata, Glyceria aquatica, Polygonum aquaticum, Triglochin maritimum, Carex meyeriana, Utricularia media等植物.
(一/二)在季节润湿的地方和介地带的优势的种类是: Carex muliensis,
Carex caplifoila, Sanguisorba filiformis, Caltha scaposa, Aster
alpinus, Deschampsia caespitosa, Blysmus sinocompressus,Gentiana
sino- ornata, Chamaesium paradoxum, Ranunculus
longicaulis/pulchellus, Trollius ranunculoides, Kobresia
humilis/parva/tibetica, Parnassia trinervis, Koeleria cristata,
Juncus leucanthus, J. concinnus, Pedicularis
resupinatus,P. rhinanthoides, Ranunculus brotherusii var.
tanguticus, Anemone obtusiloba, Eleocharis valeculosa, Koeleria
cristata, Poa chalarantha,Elymus nutans (BJOERK 1993).
如果过度放了牧的话,那疏丛草(如草熟草,披碱草)的比例减少,而密丛莎草的比例会增加.在受到地方性干扰(鼠子)的地方,根状茎的植物如Blysmus
sinocompressus, Carex enervis 和 Potentilla anserina比较多.
(二)高原褐土(安照"四川省国土资源地图集"(1990):山地黄壤黄色石灰土,安照"红原土壤"(1985):砂质草甸糊土):在白河下游介地及比较干的平坝内如唐克的二级介地和若尔盖的热尔大坝.母质为黄土状沉积物.土壤层次发育明显,表层为0-4CM的草盘根错节层,其下有黑褐色的腐殖层,厚度一般为30-40CM,有机含量为3-5%, 有碳酸盐淀积,其含量可达10%,pH为6.0-7.5,底土(40CM以下)砂质越来越多,土壤上 层有少量的还原 态亚铁斑.肥力较好,生物活动较强,特别是表层.
(二/一)辖曼砂质河谷见#刘(1994),他列出Elymus nutans,Elymus sibiricus,Geranium pylzowianum, Kobresia capillifolia (=maquensis), Anemone rivularis等植物.
(二/二)在因为过度放牧退化的地方(植被高度只有10-30CM)比较优势种类是: Stellera chamaejasme, Artemisia hedinii, Aconitum carmichaeli, Pedicularis remitorta, P.oederi, Elsholtzia densa, Eruca sativa等杂草..在干旱退化草场而论,针茅属增多,有的地方Spenceria ramalana增加.
(三)均腐殖土纲的寒毡土(原程亚高山草甸土;联合国的粮农机构的土壤图(1974) 的Histosols):海拔3420-4000M(高处变为寒冻毡土),分布在周围的高山,边界的低山,丘陵或(一般高出河水平5-8M而平面的)介地.母质多为砂页岩和板岩.因为气候冷湿土壤中的微生物分解困难,有机质多,常有几厘米后草根层,其下褐黑色土层厚度20-30CM,有机质含量可以达5-15%,pH近中性.
(三/一)这 种 土 壤 上 形
成了典型的亚高山草甸五花草地(植被高度:30-80CM),常见有:Kobresia
setchwanensis, K. kansuensis, K. capilliforma, Elymus nutans,
Roegneria nutans, Koleria litwinowii, Helitrotrichon tibeticum,
Brachypodium sylvaticum,Agrostis spp., Carex moorcroftii,Carex
filipes, Stipa aliena, Polygonum viviparum, P. amatum, P.
avicluare, P.
sibiricum, Saussurea graminea, Anaphalis hancockii, Anaphalis
lactea, Swertia franchetiana, Gentiana timensis, G. straminea,
Ranunculus pedicularis, Festuca ovina, Clinelymus sibiricus,
Trollius ranunculoides, Leontopodium longifolium, Allium cyaneum,
Scrofella chinensis, Coluria longifolia
(刘起1984,张兆清采的标本)
(三/二)阳坡:喜干燥植物如Anaphalis, Stipa, 野豌豆, Kobresia等变得更优势.
(三/三)阴坡上的灌丛草甸群体,丘坡上常见的灌丛有Spiraea
schneideriana var. amphidoxa, Potentilla fruticosa, Spiraea alpina,
Lonicera tibetica.在海拔 3800M 以上有 Rhododendron violaceum.
灌丛群体的草本植物有Helictotrichon tibeticum, Festuca rubra, F.
ovina, Elymus nutans, Brachyelytrum erectum, Poa annua, Koeleria
cristata, Ptilagrostis dichotoma, Deyeuxia scobrescens, Carex
digyna,Polygonum viviparum, P.
sphaerostachyum, Pyretherum tatsiense, Hedysarum
sikkimense,Meconopsis
spp.等(刘起1984).另外,有的屡遭人为破坏,特别是在近河谷阶地的下部,
大部分演变为农田的阳坡,次生有Caragana
tibetica和C.erinacea(高到45-50CM) 的灌木草地,伴生有Elsholtzia
fruticosa, Festuca aliena, Kobresia pygmaea, Saussurea
sp.,Potentilla multicaulis, Poa annua及Iris spp.(陈全功1992).
(三/四)河漫滩的自然堤上Rhododendron violaceum, Artemisia spp., Salix spp.,Hippophae比较优势.
(三/五)寒冻毡土:因为分布多为3800-4000M以上直到5200M在若尔盖辖曼没有,但是周围的地区有(如色达
, 石渠 ) . 植被主要为 Kobresia pygmaica, Poa sinattenuata
var.vivipara,Polygonum viviparum, Coluria longifolia, Spenceria
ramalana,Anemone geum, Anaphalis flavescens, Leontopodium
longifolium, Saussurea stella, Arenaria sp.,
Androsacetapete等(刘起1984)
.
(四)沙丘:退化严重的地带,以唐克至瓦切最多,与河道平行排列的,
还有三四列的河岸沙丘.柴等(1965)写了它们的高度在1965年2-3M,现在高度多为5-10M.沙丘上植被少,但豆科植物比较优势(松潘黄芪).详细的讨论见3.3.5.
根瘤菌相对稀少,其绝对数值很少超过土壤细菌的1%.如果单独留在土壤中,其数值回逐渐下降(#曹1994):它们作为根围生物,因此植物的根回刺激其生长.短期来说,什么植物的根都可以,长期来说恰当宿主植物的同存当然好些.#MAHLER(1982)衔谠耘嘤熊俎５奶镏熊俎８鼍壤驼500条细菌之一,而在没栽苜蓿的田中只占50000条细菌之一.#SIMANUNGKALIT(1995)煞⑾衷谒咎镏性耘嗪托菹惺逼谥秩好芏鹊姆10-1000 倍,但这些幅度好像不太依赖与植物的物种,他比譬说研究低地水稻天,发现在休闲时期每克土壤有72个根瘤菌,而栽培水稻的田每克土壤就26000个.#WIEHE(1995)I指示在温带玉米,大麦,油菜等非豆科植物根围中,根瘤菌的生长还是接近假单胞菌.他也报告一个生长其内根瘤菌能够移到离原来接种点0.6米的其他的非豆科根围.
在作物环境中,豆科植物要么作 为作物要么作绿肥.虽然紫云英,田菁等绿肥效应与一次施氮肥接近(两者在45-60天之内都能够固氮80-100KG N/HA;#BECKER 1995)酪蛭壳暗矢阋,绿肥的施用目前全球范围在下降.在四川盆地可以看到的绿肥有紫云英及野豌豆("苕子").
然而,有的豆科作物效率与绿肥接近..亚热带的四川盆地食用豆科作物有蚕豆,四季豆(全年都有,主要收获在5月),绿豆,豇豆,黄豆,扁豆及花生(主要收获在9月). 这些作物豆比较大而随植物比较大根瘤也比较宏观.比如成都的扁豆根瘤的直径可以达3CM. 固氮的产物直接到植物中,因此与常识相反有的豆科作物从土壤吸收的氮超过注入的氮(#RAO 1981:249). 幸好,如果收获之后把稿秆还到田中,这种不合理的效应是可以克服的.#TOOMSAN(1995) 估计花生的固氮率为150-220KG N/HA及黄豆的固氮率为100-152KG N/HA;如果把稿秆留到田中的话,花生田 获 得了13-100 KG N/HA;但是黄豆田还是 失 去了37-46KG N/HA. 为了对照,一此种玉米一般大概相当与取出150 KG N/HA.
连极圈以北的摩尔曼斯科北极环境中在一个野生黄芪及棘豆结瘤情况很差的地方(#ROIZIN 1959)),一片豌豆田能够固氮28-76KG N/HA(#EGOROV 1985;通过ARA测定的),而在青藏高原的拉萨地带(高度3500-4100米之间;年平均温度6-8C)进行过青颗,小麦,豌豆及蚕豆的轮作系统(#朱1990;#周1991)1.
在温带草原(如在辖曼)野生牧草当中豆科植物也,但它们一般长不到豆科作物的那么优势(#张小川1989).他们的氮含量及高,但因为它们一般整个植物生物量比例不太大,次效应如氮化合物到其余禾本植物的传递可能更为重要.这种经过豆科植物及根瘤的枯萎,分解的转化在三叶草,苜蓿等草地可以达到每年3-102KG N/HA,此相当其生物固氮的2-26%(#LEDGARD 1992,#THOMAS 1993).
在青藏高原,在红原#杨和张(1995)报告高山野生植物根瘤状况差,而#聂(1989)9在甘肃的苜蓿通过接种技术得了一定的优化.很显然影响豆科植物生物固氮的因素繁多.在下讨论温度,土壤pH及养份,盐度,湿度等对辖曼起作用的因素.
迄今被研究的豆科植物都有普通的卡尔文氏循环,其最合理温度15-25C之间(#BORDELEAU 1994) . 根瘤菌大部生长得最好在28-31C之间(而28C为培养根瘤菌是最常用的标准温度),但中华根瘤菌在35C长得好,而北极根瘤菌在5-10C可以生长(#GRAHAM 1992)9.显然,共生的最佳温度与其原有环境很有关:在亚热带地区#LIE(1971)9报告一个来自伊朗的豌豆栽培品种在20C与豌豆根瘤菌还结不到瘤,26C下才得行,而#BORDELEAU(1994)认为麦德尔氏棘豆-根瘤菌共生的最合理温度15-25C.并且,这个加拿大的研究组发现在10C下北极根瘤菌比温带的根瘤菌长得更快速,而他们测固氮酶活性直到-4C.相反,在苜蓿根瘤菌8C以下固氮霉活性及结瘤能力回停止(#CRALLE和HEICHEL 1982).但非共生的硝酸吸收当然也收到低温的影响(#ATKIN 1994)C.
如果研究结瘤能力的话应该注意到共生最佳温度与其自然来源很有关系这一点.
根瘤菌,特别是快生根瘤菌(曹景勒1994A & B,除非百脉根及热带根瘤菌以外,#GRAHAM 1992)H,对酸比细菌的大部分敏感,此在平板上很容易可以看得处.在野外,此平常是一种比较实际的问题,特别是苜蓿中华根瘤菌: #BROCKWELL(1991) 在澳大利亚的PH=7.0的土壤能够与苜蓿结瘤的根瘤菌每克有89000条,而在PH=6.0就降到仅37条. 更加畏难的是虽然#EVANS(1980)9研究豌豆根瘤菌共生发现豌豆及根瘤菌个种独立能忍耐一定的酸度,但共生对此敏感10倍.所以有时引种酸逆性根瘤菌有时有效(在圣彼德堡地区的豌豆见#FESENKO 1995)1.另外,在很低的PH(<5.0)土壤会大量释放铝,锰等离子. 这在草原不是一个大问题,但在四川盆地某些酸性土壤(比如重庆周围PH=4.4-4.6.#冯1996) 或者成都东南的龙门山可能起比较大的作用.虽然这些离子对根瘤菌影响不大,但它们抑制植物的生长,除非菌柱上的筛选以外,通过植物上的选择或者使石灰能够解决这种问题(#BORDELEAU 1994).
虽然根瘤菌细胞内大多数保持微碱性PH(#GLENN 1994)9,而多数在中性PH最优势,也有(微酸为最佳)的例外:#汤和ROBSON(1993)1发现扇玉豆根瘤菌最合理PH=6.0.
家知户晓,土壤营养的分布与PH很有关: 在酸性PH钙,磷,钼等物质变得比较稀而有关他们的刺激作用报告多(钼,见#屠1992,钙和磷见前者和#GRAHAM 1992). 因为豆科植物的磷和钾含量本身比较高,而有趣地磷好像在根瘤中积累(#GRAHAM 1992), 有很多工作者试图把固氮菌和释放磷的根菌结合起来(#BUTTERY 1992,#LYND 1995)9.
土壤中有效氮含量高的话,有的豆科植物就不在产生类黄酮(#CORONADO 1996),这样就抑制结瘤. 植物的结瘤量自我控制(#CAETANO-ANOLLES 1991)就避免植物浪费能源如果土壤还有足够的氮;已经说过当然吸收硝等态的氮也不是免费. 这种行为对发育者或草原家造麻烦,但通过适当栽培品种的选择是可以克服的. 自我控制在栽培植物随品种不同,在野生植物大部分还没有研究 过.
本节的结构基本上根者#VINCENT("芬森特",1970)和#BERGERSEN(1980)"的"经典"书.其中文版到处可以查到. 所以本节选择最新的发展(在那些资料还没有的)及对本论文有用处的技术.
在自然生态系统中的第一研究步骤是确定有无野生豆科植物及得到有关它们生物学的基本上的数据. 比如说,宿主植物的鉴定应该是"准确"或者最少可重复的(请在当地标本室保留标本).为了研究生物量动态及植物群落见#姜1988.
划一条样条,即采样的线条,是一个常用的比较"客观"的生态抽样方法. 植物生态的一种比较典兴(而大规模)的样条实验是由#CLAUSEN,KECK和HIESEY(1940,1945,1948,1952;摘要见#DAVIS和HEYWOOD 1963)(在美国加里福尼亚山区研的一条跨两座山脉的不同海拔(总海拔相差2000余米),长度几百公里的样条,他们研究的是一些常见的杂草的分布规,譬如鸢尾科的 Sisyrinchium, 菊科的 Aster, Artemisia, Achillea,Horketia,蔷薇科的Potentilla等属中各种的分布及其生态要求. 样条可以研究很多种生物学现象如昆虫(#周1992)H或鱼的分布(#弘1989).最近,#方和OHSAWA(1996)9发表了沿30北维为样条的亚洲森林分布;他们的样条就达到了整个30N北维线的1/8以上!
得到这些数据工作量较大,但是技术水平不高,而更复杂的问题是怎样分析,找出有趣的相关性. 因为未知的植物分布数据难得满足正态分布的要求,最好采用更健全的非参数统计,比如KENDALL的TAU检验, WILCOXON-MANN-WHITNEY株合检验,卡方检验等(#WALL 1986,#SPRENT 1989)9. 从统计学角度来说, 为了通过非参数统计发现一个不太明显,但也不完全隐藏的相关性,10-100的样一般比较理想.
在野外评估最粗的粗 略 而有效的方法是观察其颜色: 为了保证瘤内细菌的通气,有效根瘤包含豆血红素, 所以根瘤的颜色就示意其有效性: 白色是"不好", 红色是"好". 当然,这种观察不好数量化,因此发展了更可靠的研究方法.
固氮酶的专一性不完全: 除非氮的还原以外,它还是催化乙炔到乙烯的还原反应.因为这两种化和物都是气体的而又不是大气中的成份, 因此就比较适合与气相色谱, 从所测试的乙烯的数量就可以推算固氮量. 这在七八十年 代是一个很常用的方法,比如本省的#邓(1992) 用之测试非豆科木本植物的固氮能力. 然而,它需要迅速地把样品回到试验室(此在若尔盖就不容易)或者一个携带性气相色谱仪. 并且,乙炔还原法的数据只是一种"快照"(一般的测试时间为几个小时)而这样就不得不无视固氮是一种很多生物与非生物因素(当地氮含量,植物的不同发育阶段,温度的变动等)的稳衡过程. 所以不同的乙炔还原法有时不好比较的.
1.4.2.2. 间接的测试: 放射性标记及(自然)缺失研究
凯氏法(硫酸消化)可以鉴定任何物质的氮含量,但虽然这样可以发现豆科植物氮含量一般比其它植物高,这并不说明它的来源.然而,氮有不同的同位素,可以产生带带放射性标记的氮肥,收获以后算出放射性15-N(来自肥料)和非放射性14-N(共生固氮)的比例. 很快这就发展成"氮缺失检验",这一次就用不包含任何15-N的肥料(#LARUE和PATTISON 1981,#谢1991)P: 因为大气当中本来有0.3663%的氮是放射性的, 这样共生固氮的植物比非共生固氮的植物放射性一些. 分析精度再进一部,此就再变成了一种自然15-N同位素分部分离技术(#LEDGARD 1992,#DOUGHTON 1992, 应用见#BOLGER 1995及#MICHELSEN 1996) . 这种方法已经用不到施肥,而直接从放射性/非放射性同位素的比例算出固氮量.
这概念上很直接: 只要观察施氮肥以后生物量的产生有无反应.当然不能施得太早,要不通过氨气挥发损失太大.该主意氮肥对接种规律有没有影响.
如首次种 植一种新的豆科作物到从前没有它的田中可以拿土壤接种这是长久以来的民间知识. 发现固氮生物以来,就开了直接施用根瘤菌的路径.最早期的产品,"NITRAGIN", 1896年开始生产,当时是瓶装的纯根瘤菌发酵液(#SMITH 1992),以后逐渐发展了一套更复杂的技术. 但是把一种新的微生物弄到土壤是很容易的,而从土壤排除一种微生物天下几乎无法, 使用之前非要不可彻底研究非当地菌株的有效性.
因为根瘤菌集中于根瘤,找到根瘤菌不困难: 只该挖出一株豆科植物, 而在无菌条件榨碎其根瘤到平板. 当然,这样只能找到结瘤竞争力比较强的菌株,结瘤能力 相 对 较 差(但固氮效应可能优)的菌株就无法分离. 这样,最近发明一些直接能够从土壤发现根瘤菌的技术,其中有DNA-DNA杂交(#LOUVRIER 1995)PCR为基础的方法(#PILLAI 1992)5. 这些方法又兴起了选择性培养基的研究,有的培养基用于根瘤菌的分离,有的用于检 测.
但 是,早期的工作者(如#MUELLER 1925和#FRED 1932)2在这一点毫不乐观.甚至,有的六七十年代报告的选择性培养基(#GRAHAM 1969)后来的工作者认为不可重复(#PATTISON 1974)或不可重复(#BROMFIELD 1993). 这样最近通过分子生物学方法可以可靠地鉴定不通的菌株,对于这领域的兴趣九十年代才得了复兴. 这些报告大部分对于根瘤菌科的某一种有选择性,其中有苜蓿中华根瘤菌(#BARBER 1979,#BROMFIELD 1993,#KINKLE 1994)9, 豌豆根瘤菌(#LOUVRIER 1995), 热带根瘤菌(#SOBERON-CHAVEZ 1989), 慢生根瘤菌(#GAULT和SCHWINGHAMER 1993,#童和SADOWSKY 1994,#GOMEZ 1993)Y, 紫云英[=华癸]根瘤菌(#曹1972)9,土壤菌(#BERNAERTS 1963,#SCHROTH 1965,#CLARK 1969, #NEW 1971)9等.
因为这些报告比较分散,重新发现差不多成规律: 比如早在1907年有人报告硫酸铜对根瘤菌有选择作用(#SIMON,见#MUELLER 1925的批评), #童和SADOWSKY在1994年再发现之,#BIRO 1995很可能也算独立的发现而我们自己未知前者报告时确认过慢生根瘤菌的模式菌株. 同样,早在1915年#OLARU及#ROCASALANO(好像个人独立)报告了5-20 PPM的锰对根瘤菌的固氮起良好的作用, 以后#CLARK(1969,未知前者的工作)又用高锰为了一种对于土壤菌有选择性的培养基, 最近#APPANNA(1991)A研究北极根瘤菌的金属耐性又独立提到这个现象. 有趣的是, #PAGAN (1975))为了表明根瘤菌的根外固氮能力又选了一个锰含量比较高的培养基(他也没说为何).在初部实验中,我们也试过锰为选择性试剂,但没得明显的结果.
中等时期保存根瘤菌是在斜面上,在4C下一般可以保存3-6月. 长期保存在15%的甘油(-75或-15C)冰冻保存更好,但该避免多次解冻,再结冻.
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Table T-1.4-A: 根瘤菌分类 现状 (#Lindstroem 1996)
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Genus Rhizobium
R. leguminosarum biovar viciae (#Jordan 1984) 豌豆根瘤菌
R. leguminosarum biovar trifolii (#Jordan 1984) 三叶草根瘤菌
R. leguminosarum biovar phaseoli (#Jordan 1984) 四季豆根瘤菌
R. loti (#Jordan 1984) 百脉根根瘤菌
R. huakuii (#Chen 1991) 紫云营根瘤菌
R. galegae (#Lindstroem 1989) 山羊豆根瘤菌
R. tianshanense (#Chen 1995,proposed) 天山根瘤菌
R. tropici (#Martinez-Romero 1991) 热带根瘤菌
R. etli (#Segovia 1993) 热带四季豆根瘤菌
R. ciceri (#Nour 1995,proposed) 鹰嘴豆根瘤菌
R. hainanense (#Gao 1994, proposed) 海南根瘤菌
Genus Sinorhizobium
S. meliloti (#Jordan 1984) 苜蓿中华根瘤菌
S. fredii (#Scholla 1984) 快生黄豆中华根瘤菌
S. saheli (#Lindstroem) 萨赫尔中华根瘤菌
S. teranga (#Lindstroem) 热带树中华根瘤菌
Genus Azorhizobium
A. caulinodans (#Dreyfus 1988) 结瘤茎的根瘤菌
Genus Bradyrhizobium
Bradyrhizobium japonicum (#Jordan 1984) ("日本")慢生黄豆根瘤菌
Bradyrhizobium elkanii (cf. #Zhang 1996) 爱尔龛慢生根瘤菌
Bradyrhizobium liaoningense (#Xu 1995,proposed) ("辽宁")特慢生根瘤菌
Genus Agrobacterium(土壤菌)
根瘤菌科中的非结瘤的衍生群
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土壤大多数有很多根瘤菌菌株为抢到宿主植物剧烈而斗争,比如#DOWLING(1986)敬右桓100M2的苜蓿畦的100个植株分离了42种不同的菌株! 如果搞根瘤菌工作也难道某种土壤真正是空的,依然当地菌柱生产力比较低当然是有可能的. 这并说明,如果采用任何接种技术,菌株的鉴定是关键的. 为了鉴定根瘤菌有许多技术,其中没有一个是"最标准的",但一般来说采取的方法越多,所得的分类越可靠. 有关根瘤菌分类的摘要最近不少(#陈1985,#汪1992,#杨1993,#MARTINEZ-ROMERO 1994,#LINDSTROEM 1995)1.
范 氏,#VANDAMME (1996))评价 现 代不 同的微生物分类方法 时，把技术按照其产生的数据的信息范围分类: 分辩高等分类群,DNA定序最好(但工作量大), 为了从科到种/菌株的分辨水平,表型检验分类结果比较佳, 在种到科的范围细胞壁和脂酸分析效果比较好,种到属范围DNA-DNA杂交及GC含量分析普遍而在种/菌株低水平RFLP,DNA的扩张及MLEE的效果最清. 在下面介绍其中几种方法.
基因型的表达依赖于环境,因此表型特征没有基因特征的固定. 但是从实用角度来讲,表型数据对与某种生物的生态与培养方法带来有很大的参考价值的消息.因此,如果研究一种完全未知的菌株的话, 表型特征的描述还是最基本上的步骤之一.
有希望的宿主植物(可以按照不 同的互接种组选择)培养从表面灭菌以后接种根瘤菌的种子在斜面,三角平等或者更宽阔的无菌环境. 几周之后观察结瘤状况.
生化检验一般为微生物的在有选择性的条件下的观察,可以选择不合理的PH,盐浓度,有抑制性的染料,C/N原的利用,抗生素的抗逆性及更校准的检验,比如革兰氏染色,酸的产生,黑色素的产生等.
1.4.4.2.1.2.1. 目 前 尚 无直接鉴定根瘤菌的检验 方 法
细菌物种的定义原来多半大是它们的生物化学,而这样当然有一套生化检验能够把菌柱"定下来".通过这样的概念(最有成功的榜样是"白杰微生物分类手册")一般比较容易定到某某未知的菌柱的属,而且如果多话一点功夫到种. 不幸,根瘤菌就不 适 用于这个定义,它们是"与豆科植物能够形成根瘤的细菌",不管他们的生物化学. 因此迄今除非(平常产生假的阴性的)宿主植物检验以外,倘没有一套简便的生化检验.
因为存在了上述的困难,二战后期的时候根瘤菌分类是一个非常沉默的领域, 但因为以后(电脑的运算时间变的便宜,它随着数值分类学又活泼起来了. 数值分类学实用表型或者基因型数据的相似性把不同的分类单位排到不同的分类群(#SNEATH和SOKAL 1973;中文版:1984为了深刻的讨论).譬如说,通过数值分类#GRAHAM(1964)L说明土壤菌和根瘤菌关系密切,以后#HEBERLEIN(1967)9通过DNA-DNA杂交证明了这一点. 当然,如果需要可靠的数据(无论是植物学,#STACE 1980还是微生物),简易采用最少50-100的特征/检验. 常用的检验包括C/N利用,PH范围,盐,染料和抗生素抗逆性, 生长速度, 菌落形态, 生长温度范围, 生化检验等(#Parke and Ornston 1984,#陈 1988,#张等1991,#孙等1993,#高 1994,#Novikova 1994,#陈 1995) .
测试两种菌株相似性的最常用方法是简单的匹配参数,它设为(共同的阳性+共同的阴性)/所有的检验的数量(#SNEATH 1973)4, 有时只算共同的阳性/(共同的阳性+结果不同的检验)(#SNEATH 1957). 然而,我想提到因为我们在这儿讨论的是微生物菌落的生长,有一种比较重要的考虑: 不同的菌株的生长速度可能有区别,因此实际上比较相似的菌落看起来有区别,譬如:
检验 1 2 3 4 5 6
菌株A y y y n y y
菌株B n y n n n n
菌株C n n y y y y
(y=生长,n=没长)
看了一眼,A/C的相似性就50%,A/B为33%及B/C为17%.再仔细一看,A和B之前的所有的区别也许来自A比B这次长好些(点在平板细菌的数量高些等). #SNEATH(1968)发展了一种值得改善的排除实力上的差别的相关系数,为了详细的讨论见第四章.
说到数值分类常用算法,基本上有两种,一种是"从底望上",另一种是"从上望下".注意:在演化树的上是它的"根"(高等分类群),下是它的"分枝"及"叶"(低等分类群).从底望上(聚类分析)开始的时候把所有的菌株各看成一个OTU找(操作分类单位).以后它找出最相似的两个OTU(=单独菌株[开始]或者已经聚类好了的菌株群), 把它们合并,那就是说今后认为合并的两老OTU是一个新OTU.直到所有的菌株就合并了在一个庞大的OTU下就再重复上述的步骤.这样可以产生这些菌株的关系的一种树状数据结构,而如果画出这种树状数据结构的话比较好分不同的分类群(相当与树木图的分枝;见图T-4.2-A等).
举类分析的算法在于怎样形成新的OTU各有区别(#SNEATH 1973). 其中最常用的是UPGMA算法(#陈1986)1. 用它的话,如果譬如说我想测已带有M个菌株的OTU1和已带有N个菌株的OTU2的相似性,就改算出所有的组合(N*M)的相似性,把他算成欧几里距离(=求(1-相似系数)的方根),然后把这些N*M欧几里距离之合除于N*M算出其平均欧几里距离.
从理论角度来说,从上望下的方法还是更漂亮,因为它的目的是寻找演化最少的树木, 我们提WAGNER-FARRIS分析为例. 他的哲学与上述的举类方法相反, 开始的时候找寻两个关系最远的OTU,把它们放在二进树的根上.以后一直继续把每次离得最远的OTU放到空的分枝上(#钟1990:162; #FELSENSTEIN 1986) . 按照这个简单的规律可以产生合理的树,当然商业性(比如分析序列信息的)软件还有更复杂的优化机械. 找寻最简单的演化树是不好解决的("NP完整")的数学 题.
从上述的规律可以推想,由从低望上的算法所得的是对于低等分群比较强烈,而一个(WAGNER-FARRIS)从上望下的分析产生比较好的高等分群. 从底望上算法的一个比较大的优点在于可以几部举类以后看出来测定相似性的方法的可靠性等,反之按WAGNER-FARRIS算法先应该把整个树算出来才能得此结论.
上一段介绍的表形分类学的缺点在于:(一)得到几十种菌株的六七十种特征工作量比较大,(二)检验的选择的影响很难排除.而且通过"典型"表型分类学分高等分类单位也比较困难.遗传物质的各种近和远的差距也适宜细菌的系统分类学,比如 #WOESE(1987)挥16S rRNA序列创造所有生物的树表,发现原始细菌(甲烷杆菌,耐热细菌,极耐盐细菌)的特殊性,他一共分三种大群:真核生物,真实细菌和原始细菌.
在下面介绍四种常用的方法,可以研究各种同功酶的多样性,另一个是定序分析(定一种短而多见核苷酸片段的序列),另一个方法采用若干内切限制酶的切断形式,最后也可以用不同的引物进行PCR扩增,以后可以用电泳分析把所形成的片断分析.再一次该强调没有一个最好的方法,一般比较不同方法的结果最合理(#GRAHAM 1991).
(一) 同功酶电泳
严格来说,这种方法也是实用表型的数据,但最少是根这氨基酸序列密切有关.来自不同生物的功能相同的酶首先用电泳,以后可以用各种专一性染料染色,比较不同的带. 除非蛋白质通过转录后水平的修改以外,氨基酸序列的变化影响电泳可动性. 首先六十年代在真核生物用得最广泛,八十年代才大量在微生物上应用 (#SELANDER 1986,在根瘤菌: #MARTINEZ-ROMERO 1991,#DEMEZAS 1991,#SOUZA 1992)1.
(二) 定16S rRNA的序列
定序的不是rRNA,而是其DNA序列.rRNA占细胞总RNA的80%而重复性很大. 因此由于历史原因比较容易通过反转译所得.现在一般选择恰当的引物扩张所需的DNA片段. 定序的片断就可以比较与数据库(EMBL等)已有的序列.
这种方法主要适宜分类不同种或者亲缘关系比较远的根瘤菌. #YOUNG等(1991)R用此法说明一个本来比较特殊的菌株BTAi实际上很象日本慢生根瘤菌;而#(徐1995)1,#NOUR(1995)9, #SEGOVIA(1993)及MARTINEZ-ROMERO(1991)等用此法建设一个新的种(Bradyrhizobium liaoningensis, Rhizobium ciceri, Rhizobium etli及Rhizobium tropici).#WILLEMS和COLLINS(1993)用此方法搞所有的根瘤菌和农杆菌的树表,基本上确认当前的分类概况. 研究宿主植物的多样性(美洲的黄芪属)见#WOJCIECHOWSKI (1993)3.
(三) 内切酶形式
技术(二)用基因组的一个极小的部分中所有的信息,与此相反技术(三)和(四)用整个基因组的所有的信息一个极小的部分. 与同功酶电泳(一)不同,这个方法研究的就是周围酶的基因的DNA的结构(何处有最近的内切酶位置),而上述的同功酶电泳只研究有效酶基因里边的差距.
内切酶形式的基本上的概念是把每个生物的整个染色体通过(一种或者几种)内切酶消化,以后电泳,再把他杂交到带放射性或生物素标记的已知片断的硝化纤维素滤上(南方杂交). 这方法工作量比较大,在根瘤菌上被#KAIJALAINEN和LINDSTROEM (1989)#EARDLY(1990)陀霉.
(四) 重复性DNA的指纹法
道理: #BRITTEN和KOHNE(1968)O发现了真核生物的重复性DNA("C价反论"). DNA聚合酶的纯化就提供了复制DNA的工具,所以有关聚合酶连锁反应(PCR)的第一次实用(#SAIKI 1985)H是为了在一个真核生物(人)发现镰状细胞性贫血病的等位基因.很快就开始用重复性序列如哺乳动物的Alu为了“基因指 纹法",这就是用位置不定的序列鉴定个体. 虽然16S RNA分析对研究高等分类群还是最有效,在比较低水平的属内,种内或者群体内的分析,基因指纹法已经比工作量更大的同功酶分析或者血清分析流行.
常用的 方 法: 作为引物可以随机地选择一些很短专一性低的序列,希望着它会被扩张,此方法就是RAPD(认为扩张DNA多样性),见#Williams 1990, #Welsh和McClelland 1990, #惠1992,#曹家树1995, #Bingen 1995,#Woodburn 1995,#Fadi 1995, 在根瘤菌用有#HARRISON(1992)a及#DYE(1995)1,在苜蓿有#BRUMMER(1995))用等.
因为发表的细菌DNA序列愈来愈多,在细菌也发生了重复性片段(根瘤菌见#FLORES 1987)), 这样就开了一条更直接的路径,就是说可以选已知重复性大的序列. 实际上,所RAPD 采用 随 机 单 引 物 扩 增(假如用真正随机的引物每次作校准RAPD的条件太浪费资金,时间). 譬如说#BELKUM(1995) 因 而 被 称 为"RAPD",但其中他用下述的ERIC引物. 最著名的重复性序列(八十年代首先在大肠杆菌,此后是广泛细菌找到),叫REP("基因外重复性回文",#STERN 1984))及ERIC("肠细菌基因间同样的")序列.其功能还不清楚,但除非是"自私"的DNA,他们有一定的控制功能是最可能的(#VERSALOVIC 1991)d,可能参加与DNA聚合酶或者DNA回转酶(#DIMRI 1992,#LUPSKI 1992)9. VERSALOVIC(同上)合成了有这些序列为基础的12个指向外的引物(18-36碱对),而用PCR为产生菌株特有的指 纹. 这12个引物中他选择了ERIC及REP引物效果最佳各一套,因为可以很广泛地利用,用得比较多.有的工作者(#CASSOL研究HIV)认为REP最佳,有的认为ERIC最佳(#RODRIGUEZ-BARRADAS 1995研究根瘤菌的亲戚,巴尔通氏属).有的只用REP(#GEORGHIOU 1994),有的只用ERIC(#刘1994)O.
因为在宽大的根瘤菌基因族(#SOBRAL 1991)9这种方法愿望比较大,根瘤菌工作者早已经开始实用(#BRUIJN 1992,#JUDD 1993)2在中华根瘤菌及慢生根瘤菌的分类上.
迄今为止唯一可靠的方法是接种植物. 实验方法相研究宿主植物范围的设计. 实验室(#GIBSON 1980)奂耙巴夥椒ǘ(#VINCENT 1970),最近开始用带遗传标记的菌株(#WILSON 1995)). 有关此提一个新的摘要见#HERRIDGE 1995.
如果某种菌株明显有效,可以中等规模发酵. 纯的菌液虽然在野外可以试用,商业性的菌肥为提高产品的寿命用各种载体,比如泥炭(#RODRIGUEZ-NAVARRO 1991),聚丙烯酰胺(#HEDGE 1992)A,蛭石(#宁1993)9,土壤粉(#刘1991),滑石粉(#王1989)等. 产生菌肥的时候,活着的根瘤菌该超过种子的数量以3-5十次方,这以来与种子的大小(#OLSEN 1994)和植物物种(#PATRICK 1995)A.
在1.1.2.3节所描述的共生的详细合作通过许多生理及遗传方法被说明,而可以说根瘤菌科在细菌中是研究得最深20科之一. #BROCKWELL(1995)疵枋龈鼍蚬こ痰恼雇.有的基因工程得了很快的突破(比如#张1994让一个3.7KB的佛蕾帝中华根瘤菌的"增强因素"转到慢生根瘤菌),但不一定每个表面的进步在野外都得了证实: 比如有人产生了超级结瘤的菌株,但是因为这些菌株在田间 使 植 物 过 度 结 瘤, 导 致植 物生产量 相 应降低 (#BUTTERY 1992)5.
有的非豆科植物通过2,4-D等除草剂处理引起结瘤(#聂1991) ,但是目前不清楚的是这种处理引起的生产量增高(#刘1993)是否由于根瘤菌固氮而引起的. 比如说,有的十字化科植物(如油菜)在广泛宿主的慢生根瘤菌的存在下能够结瘤. 但是因为十字花科植物的组织对其有毒,感染不能再发展,而所有的固氮增加是所根瘤外积累的固氮螺菌产生的(#BROCKWELL 1995). 如果研究非豆科植物固氮的话,直接观察根围的其它固氮菌就更直接.
虽然这些领域的进步对我们了解根瘤菌-豆科植物固氮的以及其他共生,植物病原等 有 帮 助(#WILSON 1995)9, 但 目 前仅 限 于基 础性研究， 尚 不 具 备 应 用 天 条 件.
在 我 们 讨 论根瘤菌 优 化 的 同 时,豆科 的 优 化 研 究 也 同 样 重 要见#HERRIDGE (1995; 及#RANALLI (1995;欧洲的豌豆).
青 藏 高 原 幅 源 辽 阔， 但 科 研 及生 产 力 水 平较 低， 亟 待
提 高。 其 中 有 关 豆 科 植 物 详 细分 布，根瘤菌 分 类， 以 及 豆
科 植 物 与 根 瘤 菌 相 互 作 用 的 研 究工作 报 道 很
少。本论文主要目的是: 此包括通过 对野生豆科植物 分
布，辖曼试验场的土壤营养情况及结瘤状态的 调 查，以
及作物的接种实验， 研 究青 藏 高 原 豆 科 植 物 与 根 瘤 菌 分 布
及相 互 作 用 ， 为 今 后 的 开 发 利 用 及生 产 力 的 提 高打
下基础.